Summary
В этом протоколе описывается метод генерации цибрид из раковых клеток, растущих в суспензии, в качестве инструмента для изучения роли митохондрий в онкогенном процессе.
Abstract
В последние годы значительно возросло количество исследований, посвященных выяснению связи между митохондриями и раком. Тем не менее, все еще необходимы дополнительные усилия, чтобы полностью понять связь, связанную с изменениями в митохондриях и онкогенезе, а также для выявления митохондриальных фенотипов, связанных с опухолью. Например, чтобы оценить вклад митохондрий в процессы онкогенеза и метастазирования, важно понять влияние митохондрий опухолевых клеток в различных ядерных средах. Для этой цели один из возможных подходов состоит в переносе митохондрий в другой ядерный фон для получения так называемых клеток кибридов. В традиционных методах цибридизации клеточная линия, лишенная мтДНК (ρ0, ядерная донорская клетка), заселяется митохондриями, полученными либо из энуклеированных клеток, либо из тромбоцитов. Однако процесс энуклеации требует хорошей клеточной адгезии к культуральной пластине, особенность, которая частично или полностью теряется во многих случаях в инвазивных клетках. Кроме того, еще одна трудность, встречающаяся в традиционных методах, заключается в достижении полного удаления эндогенной мтДНК из клеточной линии митохондрий-реципиентов для получения чистых ядерных и митохондриальных фонов ДНК, избегая присутствия двух разных видов мтДНК в сгенерированном цибриде. В этой работе мы представляем протокол митохондриального обмена, применяемый к раковым клеткам, выращивающим суспензию, на основе репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями. Эта методология позволяет преодолеть ограничения традиционных подходов и, таким образом, может быть использована в качестве инструмента для расширения понимания роли митохондрий в прогрессировании рака и метастазировании.
Introduction
Перепрограммирование энергетического метаболизма является отличительной чертой рака1, который впервые наблюдался Отто Варбургом в 1930-х годах2. В аэробных условиях нормальные клетки превращают глюкозу в пируват, который затем генерирует ацетил-КоА, подпитывая митохондриальный механизм и способствуя клеточному дыханию. Тем не менее, Варбург продемонстрировал, что даже в нормоксических условиях большинство раковых клеток превращают пируват, полученный в процессе гликолиза, в лактат, изменяя свой путь к получению энергии. Эта метаболическая корректировка известна как «эффект Варбурга» и позволяет некоторым раковым клеткам удовлетворять свои энергетические потребности для быстрого роста и деления, несмотря на то, что генерация АТФ менее эффективна, чем аэробный процесс 3,4,5. В последние десятилетия многочисленные работы подтвердили влияние перепрограммирования метаболизма на прогрессирование рака. Следовательно, опухолевая энергетика считается интересной мишенью против рака1. Как центральный узел в энергетическом метаболизме и в поставке необходимых предшественников, митохондрии играют ключевую роль в этих клеточных адаптациях, которые на сегодняшний день мы понимаем лишь частично.
В соответствии с вышесказанным, мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) были предложены в качестве одной из возможных причин этого метаболического перепрограммирования, что может привести к нарушению производительности цепи переноса электронов (ETC)6 и объяснить, почему некоторые раковые клетки усиливают свой гликолитический метаболизм, чтобы выжить. Действительно, сообщалось, что мтДНК накапливает мутации в раковых клетках, присутствуя, по крайней мере, в 50% опухолей7. Например, в недавнем исследовании, проведенном Yuan et al., сообщалось о наличии гипермутированных и усеченных молекул мтДНК при раке почек, толстой кишки и щитовидной железы8. Более того, во многих работах было продемонстрировано, что определенные мутации мтДНК связаны с более агрессивным фенотипом опухоли и с увеличением метастатического потенциала раковых клеток 9,10,11,12,13,14,15,16.
Несмотря на очевидную значимость митохондриального генома в прогрессировании рака, изучение этих мутаций и их вклада в заболевание было сложным из-за ограничений в экспериментальных моделях и технологиях, доступных в настоящее время17. Таким образом, необходимы новые методы для понимания реального влияния митохондриальной ДНК на развитие и прогрессирование раковых заболеваний. В этой работе мы представляем протокол генерации трансмитохондриальных цибридов из раковых клеток, растущих в суспензии, основанный на репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями, что позволяет преодолеть основные проблемы традиционных методов кибридизации18,19. Эта методология позволяет использовать любого донора ядер независимо от наличия соответствующей им клеточной линии ρ0 и переноса митохондрий из клеток, которые, следуя традиционным методам, было бы трудно энуклеировать (т.е. неадгезивные клеточные линии).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все питательные среды и буферные композиции указаны в таблице 1. Перед генерацией цибридов должны быть типированы как митохондриальные, так и ядерные профили ДНК из донорских и реципиентных клеток, чтобы подтвердить наличие генетических различий в обоих геномах между клеточными линиями. В этом исследовании использовалась коммерчески доступная клеточная линия L929 и производная от нее клеточная линия L929dt, которая была спонтанно сгенерирована в нашей лаборатории (см.13 для получения дополнительной информации). Эти клеточные линии имеют два различия в последовательности их гена mt-Nd2 , которые могут быть использованы для подтверждения чистоты мтДНК после завершения процесса кибридизации13. При этом чистота ядерного фона была подтверждена чувствительностью к антибиотикам, поскольку, в отличие от клеток L929dt, L929 были устойчивы к генетику.
1. Истощение митохондрий при обработке родамином 6G (клетки-реципиенты)
ПРИМЕЧАНИЕ: Первым шагом для успешной генерации цибридов является полная и необратимая отмена митохондриальных функций в клетках-реципиентах. Для этого необходимо предварительно определить для каждой клеточной линии соответствующую концентрацию и продолжительность лечения родамином 6G. Эта адекватная концентрация должна быть чуть ниже вызванной лекарственным препаратом гибели клеток (самая высокая, которая не убивает клетки во время лечения). После определения оптимальных условий выполните следующие действия.
- Засейте 106 клеток в 6-луночную пластину, используя полную питательную среду (подробнее см. Таблицу 1) и ежедневно обрабатывайте их оптимальной концентрацией родамина 6G в течение 3-10 дней, в зависимости от клеточной линии. Традиционные концентрации колеблются от 2 до 5 мкг/мл в течение 3-10 дней20,21. В этом исследовании для клеток, полученных из L929, 2,5 мкг / мл родамина 6G в течение 7 дней было выбранным лечением13,22.
- Чтобы сохранить клетки живыми, дополните питательную среду 50 мкг/мл уридина и 100 мкг/мл пирувата и обновляйте его каждые 24 часа.
- После обработки и до слияния меняют среду клеток, обработанных родамином 6G, на полную среду для культивирования клеток без родамина 6G и оставляют их в этой среде на 3-4 ч в инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Токсическое действие родамина 6G необратимо, и клетки с нефункционирующими митохондриями не должны восстанавливаться20. Таким образом, после лечения клетки, не получающие функциональных митохондрий, должны погибнуть даже в питательной среде, дополненной уридином. Поэтому никакой ядерный отбор не должен быть необходим. Тем не менее, рекомендуется контрольное слияние клеток, обработанных родамином 6G, без митохондрий.
2. Экспансия и изоляция митохондрий (донорские клетки)
- Расширьте донорские клетки митохондрий во время лечения родамином 6G, чтобы получить около 25 x 106 клеток.
- На 7-й день собирают экспоненциально растущие клетки в пробирку объемом 50 мл и собирают их центрифугированием при 520 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Промойте клетки 3 раза холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и осаждайте их центрифугированием при 520 x g в течение 5 мин при RT. С этого момента выполняйте все этапы митохондриальной экстракции при температуре 4 °C, используя холодные реагенты и держа пробирки с клетками или митохондриями на льду.
- После третьего центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости путем аспирации с помощью стеклянной пипетки, соединенной с вакуумным насосом, и ресуспендируйте упакованные клетки в объеме гипотонического буфера, равном 7-кратному объему клеточной гранулы. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку гомогенизатора и дайте клеткам набухнуть, инкубируя их на льду в течение 2 минут.
- Разорвите клеточные мембраны, выполнив от 8 до 10 ударов в гомогенизаторе, соединенном с пестиком с моторным приводом, вращающимся со скоростью 600 об / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия разрушения клеточной мембраны может варьироваться в зависимости от типа клеток; Таким образом, он должен быть оптимизирован для каждого типа клеток. - Добавьте тот же объем гипертонического буфера к клеточной суспензии (в 7 раз больше объема клеточной гранулы) для создания изотонической среды.
- Перелейте гомогенат в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте его в неподвижном роторе при 1000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Затем соберите только 3/4 надосадочной жидкости, оставив большой запас от гранулы, чтобы избежать загрязнения ядрами или неповрежденными клетками, и перенесите ее в другую пробирку. Повторите тот же процесс дважды. Обратите внимание, что надосадочную жидкость необходимо сохранить, а гранулы выбросить.
- Сохранить митохондриальную фракцию (надосадочную жидкость). Переложите его в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугу на максимальной скорости (18 000 x g) в течение 2 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и промойте обогащенную митохондриями гранулу буфером А, объединив содержимое двух пробирок в одну и центрифугируя в тех же условиях, которые описаны на шаге 2.7. Повторяйте тот же процесс до тех пор, пока весь материал не окажется только в одной трубке.
- Сделайте дополнительную промывку 300 мкл буфера А и количественно определите концентрацию митохондриального белка с помощью анализаБрэдфорда 23. Для каждого анализа цибридизации необходимо определить оптимальное количество митохондрий для процедуры переноса (в нашем случае концентрация между 10-40 мкг митохондриального белка на10-6 клеток).
- Одновременно подготовьте предварительно обработанные родамином 6G клетки к слиянию, собрав их в пробирку объемом 15 мл и центрифугируя при 520 x g в течение 5 мин при RT. Обратите внимание, что гранулы приобретают неоново-розовый цвет из-за обработки родамином 6G.
- Чтобы убедиться, что как отмена митохондриальной функции в рецепторных клетках, так и очистка органелл от доноров были выполнены должным образом, засейте небольшое количество клеток, обработанных родамином 6G, и изолированных митохондрий, используя полную питательную среду, в 6-луночную пластину и культивируйте их в течение месяца, чтобы убедиться, что ни в одной из лунок не осталось выживших клеток (рис. 2).
- Параллельно оценивают отсутствие контаминантов ядер в митохондриальной фракции путем иммунодетекции ядерных белков (например, бета-ламина, гистона H3 и т. д.) или количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) амплификации ядерного гена (т. е. SDH, 18S рРНК и т. д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнений рекомендуется выполнять все этапы в асептических условиях, работая под ламинарным колпаком.
3. Слияние и генерация кибридов
- Чтобы продолжить слияние, осторожно добавьте 106 клеток, обработанных родамином 6G, в изолированную гранулу митохондрий (10-40 мкг митохондриального белка) и центрифугу при 520 x g в течение 5 мин, чтобы позволить клеткам смешаться с митохондриями.
- Добавьте 100 мкл полиэтиленгликоля (ПЭГ, 50%) и осторожно ресуспендируйте гранулу в течение 30 с. Затем дайте отдохнуть нетронутым еще 30 секунд.
- Наконец, переложите смесь в 6-луночную тарелку со свежей полной средой для культивирования клеток и поместите в инкубатор при 37 ° C с 5% CO2. Через несколько дней (обычно 1 неделя) трансмитохондриальные цибриды должны начать расти (рис. 2), давая начало клонам, которые могут быть индивидуально отобраны или смешаны в пуле перед их анализом.
4. Верификация как митохондриального, так и ядерного фона
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как новая клеточная линия была создана и клетки начали расти экспоненциально, чистота их митохондриальной и ядерной ДНК должна быть проверена. Таким образом, исходные клеточные линии должны содержать различные мутации или полиморфизмы в своих геномах, чтобы сделать их узнаваемыми.
- Полная изоляция ДНК
- Изолируют геномную ДНК всех клеточных линий, используемых для генерации цибридов, используя коммерческий набор для экстракции геномной ДНК (см. Таблицу материалов) или выполняя стандартный протокол с использованием экстракции фенол-хлороформ-изоамиловым спиртом и осажденияспирта 24.
- Оценка мтДНК (рис. 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько методов, таких как секвенирование, анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP) или аллель-специфическая кПЦР, могут быть выполнены для анализа чистоты мтДНК. Чтобы подтвердить наличие вариаций последовательности мтДНК с помощью RFLP, выполните следующие шаги протокола.- Амплифицируйте фрагмент мтДНК, содержащий нуклеотидное изменение, с помощью ПЦР.
- Здесь клетки L929dt представляют мутацию мтДНК в положении 4206 в гене mt-Nd2 (m.4206C>T), который отсутствует в клетках L929. Чтобы подтвердить наличие этой замены в трансмитохондриальных цибридах, амплифицируют фрагмент 397.н. методом ПЦР с использованием стандартного протокола и следующих праймеров: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (позиции 3862-3884) и 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (позиции 4236-4258).
- Здесь клетки L929dt представляют мутацию мтДНК в положении 4206 в гене mt-Nd2 (m.4206C>T), который отсутствует в клетках L929. Чтобы подтвердить наличие этой замены в трансмитохондриальных цибридах, амплифицируют фрагмент 397.н. методом ПЦР с использованием стандартного протокола и следующих праймеров: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Проанализируйте наличие желаемой нуклеотидной замены с помощью RFLP, используя специфическую эндонуклеазу, которая распознает изменение последовательности и генерирует различную схему разреза для обеих клеточных линий.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии варианта мтДНК L929dt (4206T) ампликон, полученный на этапе 4.2.1, содержит два сайта рестрикции для SspI (см. Таблицу материалов), которые продуцируют три фрагмента ДНК 306.н., 52.н. и 39.н. Сайт ограничения, который генерирует 52 и 39 диапазоны, нарушается при наличии версии C4206 дикого типа (WT) и появляется новая полоса 91.н. Поэтому в анализ включается внутренний контроль за полным перевариванием SspI. Реакцию сбраживания проводят при 37 °C в соответствии с инструкциями производителя. - Отделите фрагменты рестрикции с помощью электрофореза и сравните полосный рисунок.
- После того, как разложение выполнено, проанализируйте полученные фрагменты рестрикции с помощью электрофореза в 10% полиакриламид-трис-борат-ЭДТА (TBE) гелях (см. Таблицу 1 для состава 1x TBE). Проводите электрофорез при 80 В в течение 1 ч при ЛТ. Визуализируйте фрагменты ДНК после окрашивания гелем в растворе бромида этидия в 1x КЭ в течение 15 мин при ЛТ (см. Таблицу 1 для состава раствора для окрашивания геля).
- Амплифицируйте фрагмент мтДНК, содержащий нуклеотидное изменение, с помощью ПЦР.
- Генотипирование ядерной ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Генотипирование ядерной ДНК должно быть выполнено с использованием предыдущего образца экстракции ДНК, используемого для анализа RFLP.- Амплификация 16 локусов (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 и AMEL) с использованием пула коммерчески специфических олигонуклеотидов (см. Таблицу материалов).
- Проведите электрофорез с помощью генетического анализатора, чтобы отделить ранее полученные фрагменты.
ПРИМЕЧАНИЕ: После амплификации различные локусы анализируются электрофорезом с использованием капилярной системы (см. Таблицу материалов). Фрагменты отделяются в капиляре длиной 50 см, заполненном коммерческим полимером. Катодные и анодные буферы также коммерчески доступны, как показано в таблице материалов. Электрофорез проводят при напряжении 19,5 кВ в течение 20 мин при 60 °С. - Используйте биоинформационные инструменты для определения аллелей, соответствующих каждому амплифицированному локусу (см. Таблицу материалов).
- Сравните данные, полученные на шаге 4.3.3, с базой данных профиля ядерной ДНК (таблица 1), чтобы проверить, совпадает ли профиль ядерной ДНК с профилем клеточной линии рецептора митохондрий (рис. 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После следования представленному выше протоколу должна быть получена гомоплазматическая клеточная линия цибридов с консервативным ядерным фоном, но с новым генотипом митохондрий, как показано на схемах на рисунках 1 и 2. Чистота митохондриальной и ядерной ДНК, присутствующей в цибридах, может быть подтверждена RFLP, как показано на рисунке 3, и анализом генотипирования ядерной ДНК, как показано на рисунке 4.
Если перенос митохондрий был выполнен успешно, результаты, полученные с помощью анализа RFLP для клеточной линии цибридов, должны показывать разные схемы полос пищеварения по сравнению с линией клеток-реципиентов и идентичны линии донорских клеток митохондрий. Для этого фермент рестрикции должен быть выбран тщательно, убедившись, что полосные узоры, полученные в результате пищеварения, различны в обеих клеточных линиях. Один из примеров приведен на рисунке 3, на котором показаны фрагменты рестрикции, полученные после расщепления SspI в митохондриях WT и мутантных митохондриях (MUT). В случае новых трансмитохондриальных клеточных линий рестрикционные фрагменты были идентичны фрагментам, полученным в соответствующих митохондриальных донорах, и отличались от фрагментов, полученных с помощью ампликонов донорских клеток ядер. Таким образом, этот анализ подтверждает, что митохондриальный обмен был выполнен так, как ожидалось. Следует отметить, что образец из клеток-реципиентов, который не был подвергнут процедуре пищеварения, был включен в этот анализ в качестве отрицательного контроля.
Что касается ядерного генотипирования ДНК, типичный профиль, полученный в результате анализа 16 ядерных локусов для одной из клеточных линий, используемых в этом протоколе, показан на рисунке 4. Как и в случае с RFLP, сравнивая пики, полученные для каждого локуса, результаты, полученные из клеточной линии рецептора митохондрий (ядерный донор), должны совпадать с сгенерированным цибридом.
Важно отметить, что полученные результаты могут варьироваться в зависимости от разных факторов. Как мы указываем в протоколе, не все клеточные линии восприимчивы к одинаковому количеству родамина 6G для удаления всей совокупности функциональных митохондрий.
Рисунок 1: Схематическое изображение генерации cybrid, обобщающее шаги с 1 по 3 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематическое изображение, показывающее конструкцию пластины для клеточных культур после протокола цибридизации. Новая клеточная линия цибридов и контрольная группа (изолированные митохондрии и клетки-реципиенты, обработанные родамином 6G) высеваются отдельно в 6-луночную пластину. После нескольких дней культивирования клетки цибридов начинают расти, тогда как в контрольных лунках не остается выживших клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Молекулярная характеристика цибридов. (A) RFLP-анализ мутации m.4206C>T в линиях митохондриальных донорских клеток (WT и MUT, полосы 3 и 4 соответственно) и их соответствующих трансмитохондриальных клеточных линиях (MUT WT → полосе 5 иWT MUT → полосе 6). MW: маркер молекулярной массы (полоса 1); неразрезанный: непереваренный продукт ПЦР (полоса 2). (B) Карты рестрикции SspI продукта ПЦР для митохондрий WT и MUT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты анализа фона ядерной ДНК. Пример отпечатка ядерной ДНК, полученного после ПЦР-амплификации 16 локусов и разделения методом капилярного электрофореза. На рисунке показан характерный паттерн пика для каждого амплифицированного локуса клеточной линии. Этот паттерн должен отличаться для двух клеточных линий, используемых в протоколе цибридизации, чтобы подтвердить чистоту ядерной ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Терпимая | Состав | ||
| Полная питательная среда | DMEM с высоким содержанием глюкозы с L-GLN и пируватом + FBS (10%) + пенициллин-стрептомицин (1x) | ||
| Гипотонический буфер | 10 мМ MOPS, 83 мМ сахарозы, pH 7,2 | ||
| Гипертонический буфер | 30 мМ MOPS, 250 мМ сахарозы, pH 7,2 | ||
| Буфер А | 10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА, 0,32 М сахарозы, pH 7,4 | ||
| ТБЭ (1x) | 50 мМ Tris, 50 мМ борной кислоты; 1 мМ ЭДТА | ||
| Раствор для окрашивания гелем | 0,75 мкг/мл бромида этидия в 1x КЭ | ||
Таблица 1: Буферы и состав среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С тех пор, как Отто Варбург сообщил, что раковые клетки изменяют свой метаболизм и потенцируют «аэробный гликолиз»3,4 при одновременном снижении митохондриального дыхания, интерес к роли митохондрий в трансформации и прогрессировании рака вырос в геометрической прогрессии. В последние годы мутации в мтДНК и митохондриальная дисфункция были постулированы как отличительные признаки многих типов рака25. На сегодняшний день в многочисленных исследованиях проанализирована вариация мтДНК специфических опухолей 6,26,27,28,29,30,31,32, и общее бремя приобретенных мутаций мтДНК считается биомаркером онкогенности 30 при таких видах рака, как рак предстательной железы 33. В соответствии с этим, в то время как мутации мтДНК считаются инициаторами опухолей в некоторых случаях, таких как рак молочной железы 34,35 илиподжелудочной железы 36, гинекологические злокачественные новообразования 37,38, метастазы аденокарциномы легкого 15,39 или острый миелоидный лейкоз40,41, они, по-видимому, менее актуальны при глиобластомах 42.
Хотя многие виды рака содержат тяжелые мутации мтДНК, которые не обнаруживаются в здоровых тканях43 и могут способствовать инициации рака30, другие представляют полиморфные варианты мтДНК, которые распространены в различных популяциях человека. Эти варианты способствуют более мягким изменениям, которые могут быть важны для адаптации раковых клеток после того, как процесс трансформации был начат30. В любом случае, мутации мтДНК и изменения митохондриального метаболизма участвуют в прогрессировании опухоли, изменяя различные аспекты клеточного гомеостаза, такие как производство активных форм кислорода или окислительно-восстановительный статус44,45,46. Однако механизмы, с помощью которых мутации и варианты мтДНК могут способствовать онкогенезу, еще не полностью поняты. Кроме того, мутации мтДНК в раковых клетках могут сосуществовать с изменениями в ядерных генах 8,33, что затрудняет определение того, какая мутация является драйвером. В других случаях биоэнергетические потребности опухолевых клеток достигаются путем модуляции числа копии мтДНК47. С другой стороны, в некоторых случаях мутации мтДНК могут сделать опухолевые клетки более восприимчивыми к специфическим противоопухолевым препаратам48.
Чтобы полностью понять роль мутаций мтДНК в патофизиологии рака, необходимо разработать методологии, в которых мутировавшие митохондрии могут быть проанализированы в контролируемой ядерной среде. Это может помочь избежать компенсирующих эффектов ядерных генов, которые могут вызвать клеточную адаптацию. Для этой цели трансмитохондриальные цибриды представляют собой подходящую модель. Традиционные методы кибридизации включают обедненную мтДНК клеточную линию (ρ0 клеток), которая действует как донор ядер (и, следовательно, рецептор митохондрий) и донор митохондрий, обычно энуклеированной клеточной линии или тромбоцитов19, несущих варианты мтДНК или мутации, представляющие интерес. Первая проблема, которую необходимо решить при попытке создать цибриды, - это наличие ρ0-клеток, содержащих ядерный фон выбора. Получение этих клеток включает длительную обработку бромидом этидия, химическим соединением, которое ингибирует репликацию мтДНК. Однако он также может вызывать генерацию мутаций в ядерном геноме, которые могут маскировать эффекты изучаемых митохондриальных изменений. Поэтому в этой работе мы предлагаем ликвидацию целых митохондрий в клеточных линиях доноров ядер путем обработки родамином 6G, препаратом, который необратимо повреждает митохондрии и убивает клетки, если свежие митохондрии не будут введены в их цитоплазму21,22,49.
Еще одна проблема в традиционных методах генерации цибридов связана с процессом энуклеации митохондриальных донорских клеток. С этой целью адгезивные клетки центрифугируют в присутствии цитохалазина В, что позволяет выделять энуклеированные цитопласты18, способствуя дезорганизации цитоскелета. Если клетки растут в суспензии (например, гематологические линии) или теряют клеточную клеточную и клеточно-внеклеточную адгезию матрикса (что может произойти с клетками с более высоким метастатическим потенциалом50,51,52), этот протокол энуклеации будет скомпрометирован, поскольку цитопласты будут отделяться от пластины во время центрифугирования для удаления ядер, в значительной степени уменьшая их пул для последующей процедуры слияния. Чтобы обойти обе проблемы, мы предлагаем здесь протокол, в котором изолированные митохондрии сливаются с предварительно обработанными клетками родамина 6G в присутствии ПЭГ, что доказало свою экономию времени и эффективность21,22,49.
После создания трансмитохондриальных клеточных линий крайне важно оценить чистоту как митохондриальных, так и ядерных геномов. Поэтому крайне важно отбирать линии донорских клеток с различиями в последовательностях в их митохондриальной ДНК и с различимыми характеристиками, такими как устойчивость к антибиотикам или дифференциальные микросателлиты. Как описано выше, сообщалось, что некоторые виды рака модулируют свою копию мтДНК под номером47, что свидетельствует о важности анализа нагрузки мтДНК как в исходных, так и в трансмитохондриальных клеточных линиях и изучения их производительности OXPHOS в аналогичных условиях.
Основные подводные камни, скрытые в этой процедуре, связаны с процессом элиминации митохондрий с помощью родамина 6G. Каждому эксперименту по цибридизации должны предшествовать анализы для установления оптимальных условий концентрации лекарственного средства и времени лечения для выбранной линии донорских клеток ядра. Если концентрация родамина 6G или время экспозиции недостаточны, новая клеточная линия будет иметь вклад двух разных мтДНК, что усложнит фенотипический анализ. Более того, если время или доза превышают оптимальные, клетки не выживут даже после повторного заселения митохондрий. Наконец, важно быть осторожным во время процесса выделения митохондрий, чтобы избежать загрязнения неповрежденными клетками, что может изменить фенотипическую характеристику.
Несмотря на технические трудности, генерация трансмитохондриальных цибридов является мощным инструментом для разгадки вклада митохондрий в процессы рака и метастазирования и создания клеточных моделей, на которых могут быть протестированы потенциальные противоопухолевые методы лечения с использованием митохондрий в качестве терапевтической мишени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось грантом No PID2019-105128RB-I00 для RSA, JMB и AA и PGC2018-095795-B-I00 для PFS и RML, оба финансировались MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 и грантами No B31_20R (RSA, JMA и AA) и E35_17R (PFS и RML) и финансировались Gobierno de Aragón. Работа ЮАР была поддержана грантом Испанской ассоциации против кансера (AECC) PRDAR21487SOLE. Авторы хотели бы отметить использование Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
