Summary
このプロトコルは、腫瘍形成プロセスにおけるミトコンドリアの役割を研究するためのツールとして、浮遊増殖癌細胞からサイブリッドを生成するための技術について説明しています。
Abstract
近年、ミトコンドリアと癌の関係を確認することに専念する研究の数が大幅に増加しています。しかし、ミトコンドリアと腫瘍形成の変化を含む関連を完全に理解し、腫瘍関連のミトコンドリア表現型を特定するには、さらに多くの努力が必要です。例えば、腫瘍形成および転移過程におけるミトコンドリアの寄与を評価するためには、異なる核環境における腫瘍細胞からのミトコンドリアの影響を理解することが不可欠です。この目的のために、1つの可能なアプローチは、いわゆるサイブリッド細胞を得るためにミトコンドリアを異なる核の背景に移すことからなる。従来のサイブリダイゼーション技術では、mtDNA(ρ0、核ドナー細胞)を欠く細胞株に、除核細胞または血小板のいずれかに由来するミトコンドリアが再移植されます。しかしながら、除核プロセスは培養プレートへの良好な細胞接着を必要とし、浸潤性細胞では多くの場合部分的または完全に失われる特徴である。さらに、従来の方法に見られる別の困難は、ミトコンドリアレシピエント細胞株から内因性mtDNAを完全に除去して、純粋な核およびミトコンドリアDNAバックグラウンドを取得し、生成されたサイブリッドに2つの異なるmtDNA種が存在することを回避することです。この研究では、単離されたミトコンドリアを用いたローダミン6G前処理細胞の再増殖に基づいて、浮遊増殖癌細胞に適用されるミトコンドリア交換プロトコルを提示します。この方法論は、従来のアプローチの限界を克服することを可能にし、したがって、癌の進行および転移におけるミトコンドリアの役割の理解を拡大するためのツールとして使用することができる。
Introduction
エネルギー代謝の再プログラミングは、1930年代にオットー・ウォーバーグによって初めて観察された癌1の特徴です2。好気性条件下では、正常細胞はグルコースをピルビン酸に変換し、それがアセチルCoAを生成し、ミトコンドリア機構に燃料を供給し、細胞呼吸を促進します。それにもかかわらず、Warburgは、正常酸素条件下でも、ほとんどの癌細胞が解糖プロセスから得られたピルビン酸を乳酸に変換し、エネルギーを得る方法を変えることを実証しました。この代謝調節は「ウォーバーグ効果」として知られており、好気性プロセスよりもATPの生成効率が低いにもかかわらず、一部の癌細胞が急速な成長と分裂に対するエネルギー的な要求を満たすことを可能にします3,4,5。ここ数十年で、多くの研究が癌の進行における代謝再プログラミングの意味を支持してきました。したがって、腫瘍エネルギー論は癌に対する興味深い標的と考えられています1。エネルギー代謝と必須前駆体の供給の中心的なハブとして、ミトコンドリアはこれらの細胞適応において重要な役割を果たしていますが、今日まで部分的にしか理解されていません。
上記に沿って、ミトコンドリアDNA(mtDNA)変異は、この代謝リプログラミングの考えられる原因の1つとして提案されており、電子伝達系(ETC)のパフォーマンスの低下につながる可能性があり6、一部の癌細胞が解糖系代謝を増強して生き残る理由を説明します。実際、mtDNAは癌細胞内に突然変異を蓄積し、腫瘍の少なくとも50%に存在することが報告されています7。たとえば、Yuanらが実施した最近の研究では、腎臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がんにハイパー変異および切断されたmtDNA分子が存在することが報告されています8。さらに、多くの研究は、特定のmtDNA変異がより攻撃的な腫瘍表現型および癌細胞の転移能の増加と関連していることを実証している9,10,11,12,13,14,15,16。
癌の進行におけるミトコンドリアゲノムの明らかな関連性にもかかわらず、これらの突然変異の研究と疾患への寄与は、現在利用可能な実験モデルと技術の限界のために困難でした17。したがって、がん疾患の発症と進行におけるミトコンドリアDNAの実際の影響を理解するための新しい技術が必要です。この研究では、従来のシブリダイゼーション法の主な課題を克服する、単離されたミトコンドリアを用いたローダミン6G前処理細胞の再増殖に基づいて、浮遊増殖癌細胞からの伝達軟骨サイブリッド生成のためのプロトコルを紹介します18,19。この方法論は、対応するρ0細胞株の利用可能性や、従来の技術では除核が困難な細胞(すなわち、非接着性細胞株)からのミトコンドリアの移入に関係なく、任意の核ドナーの使用を可能にします。
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Protocol
注:すべての培地およびバッファー組成は 表1に規定されています。サイブリッドの生成前に、ドナー細胞とレシピエント細胞からのミトコンドリアDNAプロファイルと核DNAプロファイルの両方を入力して、細胞株間の両方のゲノムに遺伝的差異が存在することを確認する必要があります。本研究では、当研究室で自発的に作製した市販のL929細胞株とその由来細胞株L929dt(詳細は13 参照)を用いた。これらの細胞株は、 mt-Nd2 遺伝子の配列に2つの違いがあり、サイブリダイゼーションプロセスが終了した後のmtDNAの純度を確認するために使用できます13。この場合、L929dt細胞とは対照的に、L929はジェネチシンに耐性であったため、核バックグラウンドの純度は抗生物質感受性によって確認されました。
1.ローダミン6G処理によるミトコンドリア枯渇(レシピエント細胞)
注:サイブリッドの生成を成功させるための最初のステップは、レシピエント細胞のミトコンドリア機能を完全かつ不可逆的に廃止することです。この目的のために、各細胞株について、ローダミン6Gによる適切な濃度および処理期間を予め決定することが必要である。この適切な濃度は、薬物誘発性細胞死(治療中に細胞を死滅させない最高値)のすぐ下にあるはずです。最適条件を定義したら、以下を実行します。
- 完全培養培地(詳細は表1を参照)を使用して6ウェルプレートに10 6細胞を播種し、細胞株に応じて、最適濃度のローダミン6Gで3〜10日間毎日処理します。従来の濃度は、3〜10日間2〜5μg/ mLの範囲です20,21。この研究では、L929由来の細胞について、2.5 μg/mLのローダミン6Gを7日間選択した処理でした13,22。
- 細胞を生き続けるために、細胞培養培地に50 μg/mLのウリジンと100 μg/mLのピルビン酸を補充し、24時間ごとに更新します。
- 処理後および融合前に、ローダミン6G処理細胞の培地をローダミン6Gを含まない完全な細胞培養培地に交換し、5%CO2を含む37°Cのインキュベーターでこの培地に3〜4時間放置します。
注:ローダミン6G毒性作用は不可逆的であり、機能しないミトコンドリアを有する細胞は回復しないはずである20。したがって、処理後、機能的なミトコンドリアを受け取らない細胞は、ウリジンを添加した培地でも死滅するはずです。したがって、核選択は必要ないはずです。ただし、ミトコンドリアを含まないローダミン6G処理細胞のコントロール融合が推奨されます。
2.増殖とミトコンドリアの分離(ドナー細胞)
- ローダミン6G処理のタイムラプス中にミトコンドリアドナー細胞を拡大し、約25 x 106 細胞を得る。
- 7日目に、指数関数的に増殖する細胞を50 mLチューブで回収し、室温(RT)で5分間520 x g で遠心分離して回収します。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3倍洗浄し、RTで5分間520 x g で遠心分離して沈降させます。これからは、冷たい試薬を使用し、細胞またはミトコンドリアの入ったチューブを氷の上に置いて、4°Cでミトコンドリア抽出のすべてのステップを実行します。
- 3回目の遠心分離後、真空ポンプに結合したガラスピペットを用いた吸引により上清を廃棄し、充填した細胞を細胞ペレット容量の7倍に等しい低張緩衝液に再懸濁する。次に、細胞懸濁液をホモジナイザーチューブに移し、氷上で2分間インキュベートして細胞を膨潤させます。
- 600rpmで回転するモーター駆動の乳棒に結合されたホモジナイザーで8〜10ストロークを実行して、細胞膜を破壊します。
注:細胞膜破壊のステップは、細胞の種類によって異なります。したがって、細胞タイプごとに最適化する必要があります。 - 同量の高張バッファーを細胞懸濁液(細胞ペレット容量の7倍)に加えて、等張環境を生成します。
- ホモジネートを15 mLチューブに移し、1,000 x g の固定ローターで4°Cで5分間遠心分離します。 次に、ペレットから大きなマージンを残して上清の3/4のみを収集し、核または無傷の細胞による汚染を避けるために、別のチューブに移します。同じプロセスを2回繰り返します。上清は保持し、ペレットは廃棄する必要があることに注意してください。
- ミトコンドリア画分(上清)を保存します。1.5 mLチューブに移し、最高速度(18,000 x g)で4°Cで2分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、ミトコンドリア富化ペレットをバッファーAで洗浄し、2つのチューブの内容物を1つにまとめ、ステップ2.7に記載したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに入るまで、同じプロセスを繰り返します。
- 300 μLのバッファーAでさらに洗浄し、ブラッドフォードアッセイ23を使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量化します。各シブリダイゼーションアッセイについて、転写手順に最適なミトコンドリアの量を決定する必要があります(この場合、106 細胞あたり10〜40μgのミトコンドリアタンパク質の濃度)。
- 同時に、ローダミン6G前処理細胞を15 mLチューブに集め、520 x g でRTで5分間遠心分離することにより、融合用に準備します。 ペレットはローダミン6G処理によりネオンピンク色を帯びることに注意してください。
- 受容体細胞のミトコンドリア機能消失とドナーからのオルガネラ精製の両方が適切に行われていることを確認するために、ローダミン6G処理細胞を少数播種し、6ウェルプレートに完全培養液を用いてミトコンドリアを単離し、1ヶ月間培養して、どのウェルにも生存細胞が残っていないことを確認します(図2)。
- 並行して、核タンパク質(すなわち、ラミンβ、ヒストンH3など)の免疫検出または核遺伝子(すなわち、SDH、18S rRNAなど)の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)増幅によって、ミトコンドリア画分中の核汚染物質の不在を評価します。
注意: 汚染を避けるために、層流フードの下で作業する無菌状態ですべての手順を実行することをお勧めします。
3. 融合とサイブリッドの生成
- 融合を進めるには、ローダミン6G処理細胞106を単離したミトコンドリアペレット(10〜40μgのミトコンドリアタンパク質)に注意深く加え、520 x g で5分間遠心分離して、細胞がミトコンドリアと混合できるようにします。
- 100 μLのポリエチレングリコール(PEG、50%)を加え、ペレットを30秒間静かに再懸濁します。その後、さらに30秒間そのまま休ませます。
- 最後に、ミックスを新鮮な完全細胞培養培地と共に6ウェルプレートに移し、5%CO2を含む37°Cのインキュベーターに入れます。数日後(通常は1週間)、伝達性サイブリッドが成長し始め(図2)、分析前に個別に選択またはプール内で混合できるクローンが生成されます。
4. ミトコンドリアと核の背景の検証
注:新しい細胞株が確立され、細胞が指数関数的に増殖し始めたら、ミトコンドリアDNAと核DNAの純度を検証する必要があります。したがって、元の細胞株は、それらを認識できるように、ゲノム内に異なる突然変異または多型を抱いている必要があります。
- 全DNA単離
- 市販のゲノムDNA抽出キット( 材料表を参照)を使用するか、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール抽出およびアルコール沈殿を使用した標準プロトコルを実行することにより、サイブリッド生成に使用されるすべての細胞株のゲノムDNAを単離します24。
- mtDNAの評価(図3)
注:シーケンシング、制限断片長多型(RFLP)解析、対立遺伝子特異的qPCRなどのいくつかの手法を実行して、mtDNAの純度を解析できます。RFLPによるmtDNA配列変異の存在を確認するには、次のプロトコル手順に従います。- PCRによりヌクレオチド変化を含むmtDNA断片を増幅する。
- ここで、L929dt細胞は、L929細胞には存在しない mt-Nd2 遺伝子(m.4206C>T)内の4206位にmtDNA変異を示します。伝達軟骨サイブリッドにおけるこの置換の存在を確認するには、標準プロトコルおよび以下のプライマーを用いたPCRにより397 bpフラグメントを増幅します:1)5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (位置 3862-3884) および 2) 5'-TAATCAGAAGTGGGAATGGGGCG -3' (位置 4236-4258)。
- ここで、L929dt細胞は、L929細胞には存在しない mt-Nd2 遺伝子(m.4206C>T)内の4206位にmtDNA変異を示します。伝達軟骨サイブリッドにおけるこの置換の存在を確認するには、標準プロトコルおよび以下のプライマーを用いたPCRにより397 bpフラグメントを増幅します:1)5'-AAGCTATCGGG
- 配列変化を認識し、両方の細胞株に対して異なるカットパターンを生成する特異的エンドヌクレアーゼを使用して、RFLPによる所望のヌクレオチド置換の存在を分析します。
注:L929dt mtDNAバリアントが存在する場合(4206T)、ステップ4.2.1で得られたアンプリコンには、306 bp、52 bp、および39 bpの3つのDNAフラグメントを生成するSspIの2つの制限部位( 材料表を参照)が含まれます。野生型(WT)バージョンC4206が存在する場合、52および39バンドを生成する制限サイトが中断され、91bpの新しいバンドが出現します。したがって、SspIの完全消化のための内部コントロールが分析に含まれています。消化反応は、製造元の指示に従って37°Cで行われます。 - 電気泳動により制限断片を分離し、バンドパターンを比較します。
- 消化が完了したら、得られた制限断片を10%ポリアクリルアミド-トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)ゲル中で電気泳動して分析します(1x TBE組成については 表1 を参照)。電気泳動を80 VでRTで1時間実行します。 1x TBE中の臭化エチジウム溶液中でRTで15分間ゲル染色した後のDNA断片を可視化します(ゲル染色溶液の組成については 表1 を参照)。
- PCRによりヌクレオチド変化を含むmtDNA断片を増幅する。
- 核DNAジェノタイピング
注:核DNAジェノタイピングは、RFLP分析に使用された以前のDNA抽出サンプルを使用して実行する必要があります。- 市販特異的オリゴヌクレオチドのプールを使用して、16遺伝子座(D21S11、CSF1PO、vWA、D8S1179、TH01、D18S51、D5S818、D16S539、D3S1358、D2S1338、TPOX、FGA、D7S820、D13S317、D19S433、およびAMEL)を増幅します( 材料表を参照)。
- 先に得られた断片を分離するためにジェネティックアナライザーを用いて電気泳動を行う。
注:増幅されると、異なる遺伝子座はキャピラシステムを使用した電気泳動によって分析されます( 材料表を参照)。断片は、市販のポリマーで満たされた長さ50cmの毛細血管内で分離される。カソードおよびアノードバッファーも、 材料表に示すように市販されている。電気泳動は19.5 kVで60°Cで20分間行います。 - バイオインフォマティクスツールを使用して、増幅された各遺伝子座に対応する対立遺伝子を決定します( 材料表を参照)。
- ステップ4.3.3で得られたデータを核DNAプロファイルデータベース(表1)と比較し、核DNAプロファイルがミトコンドリア受容体細胞株プロファイルと一致するかどうかを確認します(図4)。
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Representative Results
上記のプロトコルに従った後、 図1 および図2の概略 図に示されているように、保存された核背景を有するが新しいミトコンドリア遺伝子型を有するホモプラズムサイブリッド細胞株が得られるはずである。サイブリッドに存在するミトコンドリアおよび核DNAの純度は、図 3に示すようにRFLPによって、および 図4に示すように核DNAジェノタイピング分析によって確認することができる。
ミトコンドリア導入が成功裏に行われた場合、サイブリッド細胞株のRFLP分析で得られた結果は、レシピエント細胞株と比較して異なる消化バンドパターンを示し、ミトコンドリアドナー細胞株と同一でなければならない。この目的のために、制限酵素を慎重に選択し、消化から得られるバンドパターンが両方の細胞株で異なることを確認する必要があります。一例を 図3に示し、WTミトコンドリアおよび変異型ミトコンドリア(MUT)におけるSspI消化後に得られた制限断片を示す。新しい伝達軟骨細胞株の場合、制限断片は、それぞれのミトコンドリアドナーで得られたものと同一であり、核ドナー細胞アンプリコンで生成されたものと異なっていました。したがって、このアッセイは、ミトコンドリア交換が予想通りに行われたことを確認する。注目すべきことに、消化手順にかけられなかったレシピエント細胞からのサンプルが、陰性対照としてこの分析に含まれた。
DNA核ジェノタイピングに関して、このプロトコルで使用された細胞株の1つについて、16の核遺伝子座の分析から得られた典型的なプロファイルを 図4に示します。RFLPと同様に、各遺伝子座について得られたピークを比較することにより、ミトコンドリア受容体細胞株(核ドナー)から得られた結果は、生成されたサイブリッドと一致するはずである。
得られる結果はさまざまな要因によって異なる可能性があることに注意することが重要です。プロトコルで示しているように、すべての細胞株が機能的なミトコンドリア全体を除去するために同じ量のローダミン6Gの影響を受けやすいわけではありません。
図1:プロトコルのステップ1〜3を要約したサイブリッド生成の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サイブリダイゼーションプロトコール後の細胞培養プレートの設計を示す模式図。新しいサイブリッド細胞株およびコントロール(単離されたミトコンドリアおよびローダミン6G処理レシピエント細胞)を6ウェルプレートに別々に播種する。数日間の培養後、サイブリッド細胞は増殖し始めますが、生き残った細胞はコントロールウェルに残りません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サイブリッドの分子特性評価。 (A)ミトコンドリアドナー細胞株(WTおよびMUT、それぞれレーン3および4)およびそれらのそれぞれの伝達軟骨細胞株(レーン5→MUT WT、およびレーン6→WTMUTにおけるm.4206C>T変異のRFLP分析)。MW:分子量マーカー(レーン1);ノーカット:非消化PCR産物(レーン2)。(B)WTおよびMUTミトコンドリアに対するPCR産物のSspI制限マップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:核DNAバックグラウンド解析の代表的な結果。 16遺伝子座のPCR増幅後に得られた核DNAフィンガープリントの例を毛細血管電気泳動により分離した。図は、細胞株の各増幅遺伝子座の特徴的なピークパターンを示しています。このパターンは、核DNAの純度を確認するためにサイブリダイゼーションプロトコルで使用される2つの細胞株で異なっていなければなりません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 中程度 | 組成 | ||
| 完全培地 | L-Glnおよびピルビン酸を含むDMEM高グルコース+ FBS(10%)+ペニシリン-ストレプトマイシン(1x) | ||
| 低張緩衝液 | 10 mM モップス, 83 mM スクロース, pH 7.2 | ||
| 高張バッファー | 30 mM モップ, 250 mM スクロース, pH 7.2 | ||
| バッファ A | 10 mM トリス, 1 mM EDTA, 0.32 M スクロース, pH 7.4 | ||
| TBE (1x) | 50mMトリス、50mMホウ酸;1 ミリム EDTA | ||
| ゲル染色液 | 0.75 μg/mL エチジウムブロミド、1x TBE中 | ||
表1:バッファーと培地組成。
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Discussion
Otto Warburgが、がん細胞が代謝をシフトさせ、ミトコンドリア呼吸を減少させながら「好気性解糖」3,4を増強することを報告して以来、がんの形質転換と進行におけるミトコンドリアの役割への関心は指数関数的に高まっています。近年、mtDNAの変異とミトコンドリア機能障害が、多くの癌型の特徴として仮定されています25。現在までに、多くの研究が特定の腫瘍のmtDNA変異6,26,27,28,29,30,31,32を分析しており、後天性mtDNA変異の総負担は、前立腺癌などの癌における腫瘍形成性のバイオマーカー30と見なされてきました33.これに沿って、mtDNA変異は、乳房34,35または膵臓36癌、婦人科悪性腫瘍37,38、肺腺癌転移15,39、または急性骨髄性白血病40,41など、場合によっては腫瘍開始剤と見なされますが、膠芽腫42ではあまり関連性がないようです。
多くのがんは、健康な組織には見られず、がんの発生に寄与する可能性のある重度のmtDNA変異を持っていますが43、他のがんは、さまざまなヒト集団に共通する多型mtDNA変異を示します。これらの変異体は、形質転換プロセスが開始された後の癌細胞の適応にとって重要であり得るより穏やかな変化を促進する30。いずれにせよ、mtDNA変異およびミトコンドリア代謝の変化は腫瘍の進行に関与し、活性酸素種の産生または酸化還元状態などの細胞恒常性の異なる側面を改変する44,45,46。しかし、mtDNAの変異や変異体が腫瘍形成を助長するメカニズムはまだ完全には理解されていません。また、がん細胞のmtDNA変異は核遺伝子の変化と共存している可能性があり8,33、どちらがドライバー変異であるかを判断するのは困難です。他の場合では、腫瘍細胞の生体エネルギー要件は、mtDNAコピー数47を調節することによって達成される。一方、場合によっては、mtDNA変異により、腫瘍細胞が特定の抗腫瘍薬の影響を受けやすくなる可能性があります48。
がんの病態生理におけるmtDNA変異の役割を完全に理解するためには、変異したミトコンドリアを制御された核環境で解析できる方法論を開発する必要があります。これは、細胞適応を引き起こす可能性のある核遺伝子の補償効果を回避するのに役立ちます。この目的のために、伝達軟骨サイブリッドは適切なモデルを表す。従来のサイブリダイゼーションの方法には、核供与体(したがってミトコンドリア受容体)として機能するmtDNA枯渇細胞株(ρ0細胞)およびミトコンドリアの供与体(通常は除核細胞株または血小板19)が含まれ、目的のmtDNA変異体または変異を有する。サイブリッドを生成しようとするときに解決すべき最初の課題は、選択した核の背景を保持するρ0細胞の利用可能性です。これらの細胞の閉塞には、mtDNA複製を阻害する化合物である臭化エチジウムによる長期治療が含まれます。しかし、それはまた、研究されるべきミトコンドリアの変化の影響を隠すことができる核ゲノム内の突然変異の生成を誘発することができる。したがって、この研究では、ミトコンドリアに不可逆的に損傷を与え、細胞質に新鮮なミトコンドリアを導入しない限り細胞を殺す薬剤であるローダミン6Gで処理することにより、核ドナー細胞株のミトコンドリア全体を排除することを提案します21,22,49。
従来のサイブリッド生成法におけるもう一つの課題は、ミトコンドリアドナー細胞の核出過程に関連している。この目的のために、接着細胞は、サイトカラシンBの存在下で遠心分離され、細胞骨格の解体を促進することによって除核細胞プラスト18の単離を可能にする。細胞が浮遊状態で増殖する場合(血液学的系統など)、または細胞間および細胞-細胞外マトリックス接着を失った場合(転移能の高い細胞に発生する可能性があります50,51,52)、細胞芽球は遠心分離中にプレートから分離して核を除去し、その後の融合手順のためのプールを大幅に減少させるため、この除核プロトコルは損なわれます。両方の課題を回避するために、ここでは、分離されたミトコンドリアをPEGの存在下でローダミン6G前処理細胞と融合させるプロトコルを提案し、時間を節約し、効率的であることが証明されています21,22,49。
伝達細胞株が生成されたら、ミトコンドリアゲノムと核ゲノムの両方の純度を評価することが重要です。したがって、ミトコンドリアDNA内の配列が異なり、抗生物質耐性や差動マイクロサテライトなどの識別可能な特性を持つドナー細胞株を選択することが重要です。上記のように、いくつかの癌はmtDNAコピー数47を調節することが報告されており、元の細胞株と伝達軟骨細胞株の両方におけるmtDNA負荷を分析し、同様の条件下でそれらのOXPHOS性能を研究することの重要性を証明しています。
この手順に隠された主な落とし穴は、ローダミン6Gによるミトコンドリア除去のプロセスに関連しています。各サイブリダイゼーション実験の前に、選択した核ドナー細胞株の薬物濃度と治療時間の最適条件を確立するためのアッセイを行う必要があります。ローダミン6G濃度または暴露時間が十分でない場合、新しい細胞株は2つの異なるmtDNAの寄与を持ち、表現型解析がより複雑になります。さらに、時間または用量が最適なものを超えると、ミトコンドリアの再増殖後も細胞は生き残れなくなります。最後に、表現型の特徴を変化させる可能性のある壊れていない細胞による汚染を避けるために、ミトコンドリアの単離プロセス中に注意することが不可欠です。
技術的な困難にもかかわらず、伝達性サイブリッドの生成は、癌および転移プロセスへのミトコンドリアの寄与を解明し、ミトコンドリアを治療標的として使用する潜在的な抗癌治療をテストできる細胞モデルを生成するための強力なツールです。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
本研究は、RSA、JMB、AAには助成金番号PID2019-105128RB-I00、PFSおよびRMLにはPGC2018-095795-B-I00の資金提供を受け、どちらもMCIN/AEI/10.13039/501100011033から資金提供を受け、助成金番号B31_20R(RSA、JMA、AA)およびE35_17R(PFSおよびRML)から資金提供を受け、Gobierno de Aragónから資金提供を受けました。RSAの活動は、アソシアシオン・エスパニョーラ・コントラ・エル・カンセル(AECC)PRDAR21487SOLEからの助成金によって支援されました。著者らは、サラゴサ大学のServicio General de Apoyo a la Investigación-SAIの使用を認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
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