Summary
Este protocolo descreve uma técnica para geração de cybrid a partir de células cancerosas em crescimento em suspensão como uma ferramenta para estudar o papel das mitocôndrias no processo tumorigênico.
Abstract
Nos últimos anos, o número de estudos dedicados a determinar a ligação entre mitocôndrias e câncer aumentou significativamente. No entanto, mais esforços ainda são necessários para compreender completamente a ligação envolvendo alterações nas mitocôndrias e tumorigênese, bem como para identificar fenótipos mitocondriais associados ao tumor. Por exemplo, para avaliar a contribuição das mitocôndrias nos processos de tumorigênese e metástases, é essencial entender a influência das mitocôndrias de células tumorais em diferentes ambientes nucleares. Para isso, uma possível abordagem consiste em transferir mitocôndrias para um fundo nuclear diferente para obter as chamadas células cybrid. Nas técnicas tradicionais de cibridização, uma linhagem celular sem mtDNA (ρ0, célula doadora nuclear) é repovoada com mitocôndrias derivadas de células enucleadas ou plaquetas. No entanto, o processo de enucleação requer boa adesão celular à placa de cultura, característica que é parcial ou completamente perdida em muitos casos em células invasivas. Além disso, outra dificuldade encontrada nos métodos tradicionais é conseguir a remoção completa do mtDNA endógeno da linhagem celular receptora mitocondrial para obter fundos de DNA nuclear e mitocondrial puro, evitando a presença de duas espécies diferentes de mtDNA no cybrid gerado. Neste trabalho, apresentamos um protocolo de troca mitocondrial aplicado a células cancerosas em crescimento em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas. Esta metodologia permite superar as limitações das abordagens tradicionais e, assim, pode ser utilizada como uma ferramenta para ampliar a compreensão do papel mitocondrial na progressão e metástase do câncer.
Introduction
A reprogramação do metabolismo energético é uma marca do câncer1 que foi observada pela primeira vez por Otto Warburg na década de 19302. Em condições aeróbicas, as células normais convertem a glicose em piruvato, que gera acetil-coA, alimentando a maquinaria mitocondrial e promovendo a respiração celular. No entanto, Warburg demonstrou que, mesmo sob condições normóxicas, a maioria das células cancerosas converte piruvato obtido do processo de glicólise em lactato, mudando seu caminho para obter energia. Esse ajuste metabólico é conhecido como "efeito Warburg" e permite que algumas células cancerosas suprim suas demandas energéticas de rápido crescimento e divisão, apesar de gerarem ATP de forma menos eficiente que o processo aeróbio 3,4,5. Nas últimas décadas, numerosos trabalhos têm apoiado a implicação da reprogramação metabólica na progressão do câncer. Assim, a energética tumoral é considerada um alvo interessante contra ocâncer1. Como um centro central no metabolismo energético e no fornecimento de precursores essenciais, as mitocôndrias desempenham um papel fundamental nessas adaptações celulares que, até o momento, compreendemos apenas parcialmente.
Em consonância com o exposto, mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido propostas como uma das possíveis causas dessa reprogramação metabólica, o que poderia levar a um comprometimento do desempenho da cadeia de transporte de elétrons (ETC)6 e explicaria por que algumas células cancerosas melhoram seu metabolismo glicolítico para sobreviver. De fato, tem sido relatado que o mtDNA acumula mutações dentro das células cancerosas, estando presente em pelo menos 50% dostumores7. Por exemplo, um estudo recente realizado por Yuan e col. relatou a presença de moléculas hipermutadas e truncadas do mtDNA em cânceres de rim, colorretal e tireoide8. Além disso, muitos trabalhos têm demonstrado que certas mutações no mtDNA estão associadas a um fenótipo tumoral mais agressivo e a um aumento no potencial metastático de células cancerígenas9,10,11,12,13,14,15,16.
Apesar da aparente relevância do genoma mitocondrial na progressão do câncer, o estudo dessas mutações e sua contribuição para a doença têm sido desafiadores devido às limitações dos modelos experimentais e tecnologias atualmentedisponíveis17. Assim, novas técnicas para entender o real impacto do DNA mitocondrial no desenvolvimento e progressão da doença oncológica são necessárias. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para geração de cibridos transmitocondriais a partir de células cancerosas em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas, que supera os principais desafios dos métodos tradicionais de cibridização18,19. Essa metodologia permite o uso de qualquer doador de núcleos independentemente da disponibilidade de sua linhagem celular ρ0 correspondente e a transferência de mitocôndrias de células que, seguindo as técnicas tradicionais, seriam difíceis de enuclear (i.e., linhagens celulares não aderentes).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos os meios de cultura e composições de buffer são especificados na Tabela 1. Antes da geração do cybrid, os perfis de DNA mitocondrial e nuclear das células doadoras e receptoras devem ser tipados para confirmar a presença de diferenças genéticas em ambos os genomas entre as linhagens celulares. Neste estudo, uma linhagem celular L929 comercialmente disponível e sua linhagem celular derivada, L929dt, que foi gerada espontaneamente em nosso laboratório (ver13 para mais informações) foram usadas. Essas linhagens celulares apresentam duas diferenças na sequência de seu gene mt-Nd2 que podem ser usadas para confirmar a pureza do mtDNA uma vez terminado o processo de cibridização13. Neste caso, a pureza do fundo nuclear foi confirmada pela sensibilidade aos antibióticos, uma vez que, ao contrário das células L929dt, as L929 foram resistentes à geneticina.
1. Depleção mitocondrial pelo tratamento com rodamina 6G (células receptoras)
NOTA: O primeiro passo para a geração bem sucedida de cybrid é abolir completa e irreversivelmente as funções mitocondriais nas células receptoras. Para isso, é necessário determinar previamente, para cada linhagem celular, a concentração adequada e a duração do tratamento com rodamina 6G. Essa concentração adequada deve estar logo abaixo da morte celular induzida por drogas (a mais alta que não mata as células durante o tratamento). Execute o seguinte assim que as condições ideais forem definidas.
- Semear10 6 células em uma placa de 6 poços usando meio de cultura completo (ver Tabela 1 para detalhes) e tratá-las diariamente com a concentração ideal de rodamina 6G por 3-10 dias, dependendo da linhagem celular. As concentrações tradicionais variam de 2 a 5 μg/mL por 3-10 dias20,21. Neste estudo, para células derivadas de L929, 2,5 μg/mL de rodamina 6G por 7 dias foi o tratamento selecionado13,22.
- Para manter as células vivas, complementar o meio de cultura celular com 50 μg/mL de uridina e 100 μg/mL de piruvato e renová-lo a cada 24 h.
- Após o tratamento e antes da fusão, trocar o meio de células tratadas com rodamina 6G para completar o meio de cultura celular sem rodamina 6G, e deixá-las neste meio por 3-4 h em estufa a 37 °C com 5% de CO2.
OBS: O efeito tóxico da rodamina 6G é irreversível, e células com mitocôndrias não funcionais não devem se recuperar20. Assim, após o tratamento, as células que não recebem mitocôndrias funcionais devem morrer mesmo em meio de cultura suplementado com uridina. Portanto, nenhuma seleção nuclear deve ser necessária. No entanto, recomenda-se uma fusão controle de células tratadas com rodamina 6G sem mitocôndrias.
2. Expansão e isolamento mitocondrial (células doadoras)
- Expandir as células doadoras mitocondriais durante o lapso de tempo do tratamento com rodamina 6G para obter cerca de 25 x 106 células.
- No dia 7, colher células de crescimento exponencial em um tubo de 50 mL e coletá-las por centrifugação a 520 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR). Lavar as células 3x com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e sedimentá-las por centrifugação a 520 x g por 5 min em RT. A partir de agora, execute todas as etapas da extração mitocondrial a 4 °C, usando reagentes frios e mantendo os tubos com células ou mitocôndrias sobre gelo.
- Após a terceira centrifugação, descartar o sobrenadante por aspiração utilizando pipeta de vidro acoplada a uma bomba de vácuo e ressuspender as células empacotadas em um volume de tampão hipotônico igual a 7x o volume da pastilha celular. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo homogeneizador e deixe as células incharem incubando-as no gelo por 2 min.
- Quebre as membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes no homogeneizador acoplado a um pilão acionado por motor girando a 600 rpm.
NOTA: A etapa de ruptura da membrana celular pode variar entre os tipos celulares; assim, ele tem que ser otimizado para cada tipo de célula. - Adicione o mesmo volume de tampão hipertônico à suspensão celular (7x o volume da pastilha celular) para gerar um ambiente isotônico.
- Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 mL e centrifuga-lo em um rotor fixo a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Em seguida, colete apenas 3/4 do sobrenadante deixando uma grande margem do pellet, para evitar contaminação com núcleos ou células intactas, e transfira-o para outro tubo. Repita o mesmo processo duas vezes. Observe que o sobrenadante deve ser mantido e o pellet descartado.
- Salve a fração mitocondrial (sobrenadante). Transferir para tubos de 1,5 ml e centrifugar à velocidade máxima (18.000 x g) durante 2 min a 4 °C.
- Eliminar o sobrenadante e lavar o pellet enriquecido com mitocôndrias com tampão A, combinando o conteúdo dos dois tubos num só e centrifugando nas mesmas condições descritas no passo 2.7. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.
- Realizar uma lavagem adicional com 300 μL de tampão A e quantificar a concentração de proteínas mitocondriais utilizando o ensaio de Bradford23. Para cada ensaio de cibridização, a quantidade ideal de mitocôndrias para o procedimento de transferência deve ser determinada (no nosso caso, uma concentração entre 10-40 μg de proteína mitocondrial por 10a 6 células).
- Simultaneamente, prepare as células pré-tratadas com rodamina 6G para a fusão, coletando-as em um tubo de 15 mL e centrifugando a 520 x g por 5 min na RT. Observe que o pellet adquire uma cor rosa neon devido ao tratamento com rodamina 6G.
- Para garantir que tanto a abolição da função mitocondrial nas células receptoras quanto a purificação da organela dos doadores tenham sido realizadas adequadamente, semeie um pequeno número de células tratadas com rodamina 6G e isole mitocôndrias usando o meio de cultura completo em uma placa de 6 poços e cultive-as por um mês para verificar se nenhuma célula sobrevivente permanece em nenhum dos poços (Figura 2).
- Em paralelo, avaliar a ausência de contaminantes nucleares na fração mitocondrial por imunodetecção de proteínas nucleares (i.e., lamina beta, histona H3, etc.) ou por amplificação quantitativa por reação em cadeia da polimerase (qPCR) de um gene nuclear (i.e., SDH, 18S rRNA, etc.).
OBS: Para evitar contaminações, recomenda-se realizar todas as etapas em condições assépticas trabalhando sob uma capela de fluxo laminar.
3. Fusão e geração de cybrid
- Para prosseguir com a fusão, adicione cuidadosamente 106 das células tratadas com rodamina 6G à pastilha mitocondrial isolada (10-40 μg de proteína mitocondrial) e centrifugar a 520 x g por 5 min para permitir que as células se misturem com as mitocôndrias.
- Adicionar 100 μL de polietilenoglicol (PEG, 50%) e ressuspender suavemente o pellet por 30 s. Em seguida, deixe descansar intocado por mais 30 s.
- Finalmente, transfira a mistura para uma placa de 6 poços com meio de cultura de células completo fresco e coloque na incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Após alguns dias (geralmente 1 semana), os cybrids transmitocondriais devem começar a crescer (Figura 2), dando origem a clones que podem ser selecionados individualmente ou misturados em um pool antes de sua análise.
4. Verificação do fundo mitocondrial e nuclear
NOTA: Uma vez que a nova linhagem celular foi estabelecida e as células começam a crescer exponencialmente, a pureza de seus DNAs mitocondriais e nucleares deve ser verificada. Assim, as linhagens celulares originais devem abrigar diferentes mutações ou polimorfismos dentro de seus genomas para torná-las reconhecíveis.
- Isolamento total do DNA
- Isolar o DNA genômico de todas as linhagens celulares usadas para geração de cybrid empregando um kit comercial de extração de DNA genômico (ver Tabela de Materiais) ou realizando um protocolo padrão usando extração de álcool fenol-clorofórmio-isoamílico e precipitação de álcool24.
- Avaliação do mtDNA (Figura 3)
NOTA: Várias técnicas, tais como sequenciamento, análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) ou qPCR alelo-específico, podem ser realizadas para analisar a pureza do mtDNA. Para confirmar a presença de variações na sequência do mtDNA por RFLP, siga os próximos passos do protocolo.- Amplificar um fragmento de mtDNA contendo a alteração nucleotídica por PCR.
- Aqui, as células L929dt apresentam uma mutação do mtDNA na posição 4206, dentro de um gene mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente nas células L929. Para confirmar a presença desta substituição nos cíbridos transocondriais, amplificar um fragmento de 397 pb por PCR usando um protocolo padrão e os seguintes primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (posições 3862-3884) e 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posições 4236-4258).
- Aqui, as células L929dt apresentam uma mutação do mtDNA na posição 4206, dentro de um gene mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente nas células L929. Para confirmar a presença desta substituição nos cíbridos transocondriais, amplificar um fragmento de 397 pb por PCR usando um protocolo padrão e os seguintes primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Analisar a presença da substituição nucleotídica desejada por RFLP, utilizando uma endonuclease específica que reconhece a mudança de sequência e gera um padrão de corte diferente para ambas as linhagens celulares.
NOTA: Quando a variante L929dt mtDNA está presente (4206T), o amplicon obtido na etapa 4.2.1 contém dois sítios de restrição para SspI (ver Tabela de Materiais) que produz três fragmentos de DNA de 306 pb, 52 pb e 39 pb. O site de restrição que gera as bandas 52 e 39 é interrompido quando a versão wild-type (WT) C4206 está presente e uma nova banda de 91 bp aparece. Portanto, um controle interno para digestão completa para SspI é incluído na análise. A reação de digestão é realizada a 37 °C, seguindo as instruções do fabricante. - Separe os fragmentos de restrição por eletroforese e compare o padrão de banda.
- Uma vez realizada a digestão, analisar os fragmentos de restrição obtidos por eletroforese em géis de poliacrilamida-Tris-borato-EDTA (TBE) a 10% (ver Tabela 1 para composição de 1x TBE). Executar a eletroforese a 80 V por 1 h na RT. Visualize os fragmentos de DNA após a coloração em gel em uma solução de brometo de etídio em 1x TBE por 15 min em RT (ver Tabela 1 para composição da solução de coloração em gel).
- Amplificar um fragmento de mtDNA contendo a alteração nucleotídica por PCR.
- Genotipagem do DNA nuclear
NOTA: A genotipagem do DNA nuclear deve ser realizada usando a amostra de extração de DNA anterior empregada para análise de RFLP.- Amplifique 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 e AMEL) usando um pool de oligonucleotídeos específicos comerciais (consulte a Tabela de Materiais).
- Realizar eletroforese utilizando analisador genético para separar os fragmentos previamente obtidos.
NOTA: Uma vez amplificados, os diferentes loci são analisados por eletroforese usando um sistema capilar (ver Tabela de Materiais). Os fragmentos são separados em um capilar de 50 cm de comprimento preenchido com um polímero comercial. Tampões catódicos e anódicos também estão disponíveis comercialmente, como mostrado na Tabela de Materiais. A eletroforese é realizada a 19,5 kV por 20 min a 60 °C. - Use ferramentas bioinformativas para determinar os alelos correspondentes a cada locus amplificado (ver Tabela de Materiais).
- Comparar os dados obtidos na etapa 4.3.3 com o banco de dados de perfil de DNA nuclear (Tabela 1), para verificar se o perfil de DNA nuclear coincide com o perfil de linhagem celular do receptor mitocondrial (Figura 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após seguir o protocolo acima apresentado, deve-se obter uma linhagem celular homoplasmática cybrid com fundo nuclear conservado, mas com um novo genótipo mitocondrial, conforme representado nos esquemas da Figura 1 e Figura 2. A pureza do DNA mitocondrial e nuclear presente nos cibrídeos pode ser confirmada por RFLP, como mostrado na Figura 3, e pela análise de genotipagem do DNA nuclear, como mostrado na Figura 4.
Se a transferência mitocondrial foi feita com sucesso, os resultados obtidos com a análise de RFLP para a linhagem celular cybrid devem mostrar padrões de banda de digestão diferentes em comparação com a linhagem celular receptora e idênticos à linhagem celular doadora mitocôndria. Para isso, a enzima de restrição deve ser escolhida cuidadosamente, certificando-se de que os padrões de bandas obtidos a partir da digestão sejam diferentes em ambas as linhagens celulares. Um exemplo é dado na Figura 3, na qual são mostrados os fragmentos de restrição obtidos após a digestão com SspI em mitocôndrias WT e mitocôndrias mutantes (MUT). No caso das novas linhagens celulares transmito-dondas, os fragmentos de restrição foram idênticos aos obtidos em seus respectivos doadores mitocondriais e diferentes daqueles gerados com os amplicons celulares doadores de núcleos. Assim, este ensaio confirma que a troca mitocondrial foi realizada conforme o esperado. Vale ressaltar que uma amostra de células receptoras que não foi submetida ao procedimento de digestão foi incluída nesta análise como controle negativo.
Em relação à genotipagem nuclear do DNA, um perfil típico obtido a partir da análise de 16 loci nucleares para uma das linhagens celulares utilizadas neste protocolo é mostrado na Figura 4. Semelhante ao RFLP, comparando-se os picos obtidos para cada locus, os resultados obtidos da linhagem celular receptora mitocondrial (doador nuclear) devem coincidir com o cybrid gerado.
É importante ressaltar que os resultados obtidos podem variar de acordo com diferentes fatores. Como indicamos no protocolo, nem todas as linhagens celulares são suscetíveis à mesma quantidade de rodamina 6G para remoção da totalidade das mitocôndrias funcionais.
Figura 1: Representação esquemática da geração de cybrid, resumindo os passos 1 a 3 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática mostrando o desenho da placa de cultura celular após o protocolo de cibridização. Uma nova linhagem de células cybrid e controles (mitocôndrias isoladas e células receptoras tratadas com rodamina 6G) são semeadas separadamente em uma placa de 6 poços. Após alguns dias de cultura, as células cybrid começam a crescer, enquanto nenhuma célula sobrevivente permanece nos poços de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização molecular dos cibrídeos. (A) Análise por RFLP da mutação m.4206C>T em linhagens celulares de doadores mitocondriais (WT e MUT, faixas 3 e 4, respectivamente) e suas respectivas linhagens celulares transmitocondriais (MUT WT → lane 5 eWT MUT → lane 6). MW: marcador de peso molecular (raia 1); sem cortes: produto de PCR não digerido (faixa 2). (B) Mapas de restrição SspI do produto de PCR para mitocôndrias WT e MUT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da análise de fundo do DNA nuclear. Exemplo da impressão digital do DNA nuclear obtida após amplificação por PCR de 16 loci e separação por eletroforese capilar. A figura mostra o padrão de pico característico para cada loci amplificado de uma linhagem celular. Este padrão deve ser diferente para as duas linhagens celulares usadas no protocolo de cibridização para confirmar a pureza do DNA nuclear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Média | Composição | ||
| Meio de cultura completo | DMEM glicose alta com L-Gln e piruvato + FBS (10%) + Penicilina-Estreptomicina (1x) | ||
| Tampão hipotônico | MOPS 10 mM, sacarose 83 mM, pH 7,2 | ||
| Tampão hipertônico | MOPS 30 mM, sacarose 250 mM, pH 7,2 | ||
| Buffer A | Tris 10 mM, EDTA 1 mM, sacarose 0,32 M, pH 7,4 | ||
| TBE (1x) | Tris 50 mM, ácido bórico 50 mM; 1 mM EDTA | ||
| Solução corante em gel | 0,75 μg/mL de brometo de etídio em 1x TBE | ||
Tabela 1: Buffers e composição da mídia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desde que Otto Warburg relatou que as células cancerosas alteram seu metabolismo e potencializam a "glicólise aeróbica"3,4 enquanto reduzem a respiração mitocondrial, o interesse no papel das mitocôndrias na transformação e progressão do câncer tem crescido exponencialmente. Nos últimos anos, mutações no mtDNA e disfunção mitocondrial têm sido postuladas como características de muitos tipos decâncer25. Até o momento, numerosos estudos têm analisado a variação do mtDNA de tumores específicos 6,26,27,28,29,30,31,32, e a carga total de mutações adquiridas no mtDNA tem sido considerada um biomarcador de tumorigenicidade 30 em cânceres como o câncer depróstata33. Em consonância com isso, enquanto mutações no mtDNA são consideradas iniciadores tumorais em alguns casos, como em cânceres demama34,35 ou pâncreas36, neoplasias ginecológicas37,38, metástases de adenocarcinoma de pulmão15,39 ou leucemia mieloide aguda40,41, elas parecem ser menos relevantes em glioblastomas42.
Embora muitos cânceres apresentem mutações graves no mtDNA que não são encontradas em tecidos saudáveis43 e possam contribuir para o início do câncer30, outros apresentam variantes polimórficas do mtDNA que são comuns em várias populações humanas. Essas variantes promovem alterações mais leves que podem ser importantes para a adaptação das células cancerígenas, uma vez iniciado o processo de transformação30. De qualquer forma, mutações no DNA mitocondrial e alterações no metabolismo mitocondrial estão envolvidas na progressão tumoral, modificando diferentes aspectos da homeostase celular, como a produção de espécies reativas de oxigênio ou o status redox44,45,46. No entanto, os mecanismos pelos quais mutações e variantes do mtDNA podem favorecer a tumorigênese ainda não estão completamente esclarecidos. Além disso, mutações no DNA mitocondrial em células cancerosas podem coexistir com alterações em genes nucleares 8,33, tornando difícil determinar qual é a mutação condutora. Em outros casos, as exigências bioenergéticas das células tumorais são alcançadas pela modulação da cópia do mtDNA número47. Por outro lado, em alguns casos, mutações no mtDNA poderiam tornar as células tumorais mais suscetíveis a drogas antitumorais específicas48.
Para compreender completamente o papel das mutações do mtDNA na fisiopatologia do câncer, é necessário desenvolver metodologias nas quais mitocôndrias mutadas possam ser analisadas em um ambiente nuclear controlado. Isso pode ajudar a evitar efeitos compensatórios de genes nucleares que poderiam desencadear a adaptação celular. Para este propósito, os cibrídeos transmitocondrais representam um modelo apropriado. Os métodos tradicionais de cibridização envolvem uma linhagem celular empobrecida de mtDNA (células ρ0) que atua como doadora de núcleos (e, portanto, receptor de mitocôndrias) e doadora de mitocôndrias, geralmente uma linhagem celular enucleada ouplaquetas19, carregando as variantes ou mutações do mtDNA de interesse. O primeiro desafio a ser resolvido ao tentar gerar cybrids é a disponibilidade de células ρ0 abrigando o fundo nuclear de escolha. A obtenção dessas células envolve tratamento a longo prazo com brometo de etídio, um composto químico que inibe a replicação do mtDNA. No entanto, também pode induzir a geração de mutações dentro do genoma nuclear que poderiam mascarar os efeitos das alterações mitocondriais a serem estudadas. Portanto, neste trabalho, propomos a eliminação de mitocôndrias inteiras em linhagens celulares de doadores de núcleos pelo tratamento com rodamina 6G, uma droga que danifica irreversivelmente as mitocôndrias e mataria as células a menos que mitocôndrias frescas sejam introduzidas em seu citoplasma21,22,49.
Outro desafio nos métodos tradicionais de geração de cibridos está relacionado ao processo de enucleação das células doadoras mitocondriais. Para isso, células aderentes são centrifugadas na presença de citocalasina B, o que permite o isolamento de citoplastos enucleados18 por promover a desorganização do citoesqueleto. Se as células crescerem em suspensão (como linhas hematológicas) ou tiverem perdido adesão célula-célula e célula-matriz extracelular (o que pode acontecer com aquelas com maior potencial metastático50,51,52), esse protocolo de enucleação ficaria comprometido, uma vez que os citoplastos se desprenderiam da placa durante a centrifugação para remover os núcleos, reduzindo em grande parte seu pool para o procedimento de fusão subsequente. Para contornar ambos os desafios, propomos aqui um protocolo no qual mitocôndrias isoladas são fundidas com células pré-tratadas com rodamina 6G na presença de PEG, que tem se mostrado eficiente e demorado21,22,49.
Uma vez que as linhagens celulares transmitocondriais são geradas, é crucial avaliar a pureza dos genomas mitocondrial e nuclear. Portanto, é fundamental selecionar linhagens celulares de doadores com diferenças de sequência dentro de seu DNA mitocondrial e com características distinguíveis, como resistência a antibióticos ou microssatélites diferenciais. Como descrito acima, alguns cânceres têm sido relatados para modular sua cópia de mtDNA número47, evidenciando a importância de analisar a carga de mtDNA em linhagens celulares originais e transmitochondrial e estudar seu desempenho OXPHOS sob condições semelhantes.
As principais armadilhas escondidas neste procedimento estão ligadas ao processo de eliminação mitocondrial com rodamina 6G. Cada experimento de cibridização deve ser precedido de ensaios para estabelecer as condições ótimas de concentração da droga e tempo de tratamento para a linhagem celular doadora de núcleo selecionada. Se a concentração de rodamina 6G ou o tempo de exposição não forem suficientes, a nova linhagem celular terá a contribuição de dois mtDNAs diferentes, o que adicionará maior complexidade à análise fenotípica. Além disso, se o tempo ou a dose excederem os ideais, as células não sobreviverão mesmo após o repovoamento mitocondrial. Finalmente, é essencial ter cuidado durante o processo de isolamento mitocondrial para evitar a contaminação com células intactas, o que poderia alterar a caracterização fenotípica.
Apesar das dificuldades técnicas, a geração de cíbridos transocondriais é uma ferramenta potente para desvendar a contribuição mitocondrial para processos de câncer e metástases e gerar modelos celulares onde potenciais tratamentos anticâncer usando mitocôndrias como alvo terapêutico podem ser testados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo número de concessão PID2019-105128RB-I00 para RSA, JMB e AA, e PGC2018-095795-B-I00 para PFS e RML, ambos financiados por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e números de concessão B31_20R (RSA, JMA e AA) e E35_17R (PFS e RML) e financiados por Gobierno de Aragón. O trabalho da RSA foi apoiado por uma bolsa da Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Os autores gostariam de agradecer o uso do Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
