Embryobaseret kemisk toksicitetsskærm: Vurdering af virkninger på udvikling af zebrafiskembryoner

- Begynd med at tilsætte 5 embryoner i E3 medium til hver brønd af en 96-brønds plade, og fjern det overskydende medium med en pipette. Tilsæt E3 medium indeholdende kanamycin i hver brønd for at forhindre forurening. Lad embryonerne vokse ved 28 grader Celsius.

Fortynd forbindelsen af interesse med et passende opløsningsmiddel, såsom DMSO, for at forberede flere koncentrationer eller doser, og test virkningen af hver dosis på udviklingen af embryoner. Når embryonerne når det ønskede stadium, pipette hver bestandsopløsning i individuelle brønde. Dæk pladen med et låg og hvæsser den forsigtigt for at blande indholdet. Lad embryonerne i brøndpladen vokse ved 28 grader Celsius.

På det ønskede tidspunkt i embryonal udvikling skal du placere brøndpladen under et passende mikroskop for at undersøge embryonernes fænotype. Du kan observere fænotyper som tab af øjne, forsinket vækst eller tab af melanocytter i de udviklende embryoner. I den følgende protokol tester vi et sammensat bibliotek for små molekylehæmmere af forhjernens udvikling.

- Små molekylebiblioteker leveres typisk i en 96-brønds kildeplade med hver forbindelse gemt i DMSO som en 10 millimolar bestand. Ca. 60 minutter før embryonerne når det ønskede stadium, optøs et passende antal 96-brøndsplader, der indeholder aliquots af små molekyler.

Drej kort pladerne ned i en bordpladecentrifuge udstyret med en multibrøndpladeadapter. Fjern aluminiumsforseglingstapet fra kildepladen. Ved hjælp af en 12-kanals pipette fortyndes forbindelserne i kildepladen til den ønskede koncentration med DMSO. I denne protokol bruger vi en 0,5 millimolar endelig koncentration og tilsæt 4,75 mikroliter DMSO for at fortynde den 10 millimolar lagerplade.

Når embryonerne i 96-brøndspladen når det ønskede stadium, skal du bruge en 12-kanals pipette til at overføre 2,5 mikroliter forbindelser fra kildepladerne til modtagerpladerne, der indeholder embryonerne. Dæk pladerne, der nu indeholder embryoner og forbindelser med låg, og registrer identifikationsnummeret på kildepladerne på embryopladerne. Bland pladerne ved forsigtigt hvirvlende, og læg dem i en 28,5 grader Celsius inkubator. Dæk hver kildeplade, der indeholder ubrugte små molekyler med aluminiumsforseglingstape og læg dem i en minus 80 grader Celsius fryser til langtidsopbevaring.

Før du udfører den visuelle skærm, formulere et specifikt hit kriterium. For eksempel, i en skærm for små molekyle hæmmere af forhjernen udvikling, et hit kan være en forbindelse, der giver tab af forhjernen. Fravær af øjne er en nem visuel indikator for tabet af forhjernen og kræver ingen fluorescens til assay.

På de ønskede tidspunkter i udviklingen, fjern 96-brøndspladerne, der indeholder sammensatte behandlede embryoner, fra inkubatoren, og undersøg hver brønd under et stereomikroskop. Ved screening for små molekylehæmmere af forhjernens udvikling undersøges pladerne efter 28 timer for tab af øjet som en markør for forhjernens udviklingshæmmende hæmning.

Placer 96-brøndspladen tilbage i inkubatoren. Bekræfte tab af øjne og forhjernen på 48 timer. Selv om embryonerne ikke vil have en forhjernen, vil de overleve til mindst fire dage. Bekræfte et potentielt hit ved at teste virkningerne af forbindelsen ved flere doser. For hver dosis, 10 embryoner er testet i 0,5 milliliter E3 medier i en 48-godt format plade.

Timingen af sammensatte tilsætning til gentestning bør være identisk med timingen af den oprindelige screening.