מסך רעילות כימית המבוסס על עובר: הערכת השפעות על פיתוח עוברי זברה

- התחל על ידי הוספת 5 עוברים ב E3 בינוני לכל באר של צלחת 96-well, ולהסיר את המדיום עודף עם פיפטה.

לדלל את המתחם של עניין עם ממס מתאים, כגון DMSO, כדי להכין כמה ריכוזים או מינונים, ולבדוק את ההשפעה של כל מנה על העוברים המתפתחים.

בזמן הרצוי בהתפתחות העוברית, מניחים את צלחת הבאר תחת מיקרוסקופ מתאים כדי לבחון את הפנוטיפ של העוברים.

- ספריות מולקולות קטנות מסופקות בדרך כלל בלוח מקור של 96 באר עם כל תרכובת המאוחסנת ב- DMSO כמלאי של 10 מילימולאר. כ-60 דקות לפני שהעוברים מגיעים לשלב הרצוי, מפשירים מספר מתאים של צלחות 96 באר המכילות צינורות של מולקולות קטנות.

בקצרה לסובב את הצלחות בצנטריפוגה שולחן מצויד מתאם צלחת רב היטב. הסר את קלטת איטום האלומיניום מלוח המקור. באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, לדלל את התרכובות בלוח המקור לריכוז הרצוי עם DMSO. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בריכוז סופי 0.5 מילימולאר ומוסיפים 4.75 מיקרוליטרים של DMSO כדי לדלל את צלחת המלאי 10 מילימולאר.

כאשר העוברים בצלחת 96 באר להגיע לשלב הרצוי, להשתמש פיפטה 12 ערוצים להעביר 2.5 microliters של תרכובות מצלחות המקור לתוך לוחות המטופל המכיל את העוברים. מכסים כעת את הצלחות המכילות את העוברים והתרכובות במכסים ומתעדים את מספר הזיהוי של לוחות המקור על לוחות העובר.

לפני ביצוע המסך החזותי, לנסח קריטריון להיט ספציפי. לדוגמה, במסך עבור מעכבי מולקולה קטנים של התפתחות המוח, להיט עשוי להיות תרכובת המעניקה את אובדן המוח.

בזמנים הרצויים בפיתוח, להסיר את צלחות 96-באר המכילים עוברים מטופלים מורכבים מן האינקובטור ולבחון כל באר תחת מיקרוסקופ סטריאו. בעת הקרנה עבור מעכבי מולקולה קטנים של התפתחות forebrain, לבחון צלחות ב 28 שעות לאובדן העין כסמן של עיכוב התפתחותי forebrain.

מניחים את צלחת 96 הבאר בחזרה באינקובטור. לאשר מחדש את אובדן העיניים ואת forebrain ב 48 שעות. למרות העוברים לא יהיה forebrain, הם ישרדו לפחות ארבעה ימים.

העיתוי של תוספת מורכבת לבדיקה חוזרת צריך להיות זהה לזה של ההקרנה המקורית. להיט מאושר כאשר פנוטיפ עורר משוחזר באופן תלוי מינון על בדיקה חוזרת של המתחם. לבסוף, לזהות את תרכובת הלהיט מתוך מסד הנתונים של מולקולות קטנות בספרייה הכימית.