Embryo-Based Chemical Toxicity Screen: Assessing Effects on Developing Zebrafish Embryos

- Beginnen Sie mit der Zugabe von 5 Embryonen in E3 Medium zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte, und entfernen Sie das überschüssige Medium mit einer Pipette. Fügen Sie E3 Medium mit Kanamycin in jedem Brunnen, um Kontamination zu verhindern. Lassen Sie die Embryonen bei 28 Grad Celsius wachsen.

Verdünnen Sie die Zinsverbindung mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie DMSO, um mehrere Konzentrationen oder Dosen vorzubereiten, und testen Sie die Wirkung jeder Dosis auf sich entwickelnde Embryonen. Sobald die Embryonen das gewünschte Stadium erreicht haben, pipette jede Lagerlösung in einzelne Brunnen. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und wirbeln Sie sie sanft, um den Inhalt zu mischen. Lassen Sie die Embryonen in der Brunnenplatte bei 28 Grad Celsius wachsen.

Zur gewünschten Zeit in der embryonalen Entwicklung legen Sie die Brunnenplatte unter ein geeignetes Mikroskop, um den Phänotyp der Embryonen zu untersuchen. Sie können Phänotypen wie Augenverlust, verzögertes Wachstum oder Verlust von Melanozyten in den sich entwickelnden Embryonen beobachten. Im folgenden Protokoll werden wir eine zusammengesetzte Bibliothek auf kleine Molekülinhibitoren der Vorhirnentwicklung testen.

- Kleine Molekülbibliotheken werden in der Regel in einer 96-Well-Quellenplatte mit jeder in DMSO als 10 Millimolaren Lager gelagerten Verbindung geliefert. Etwa 60 Minuten, bevor die Embryonen das gewünschte Stadium erreichen, tauen Sie eine entsprechende Anzahl von 96-Well-Platten auf, die Aliquots von kleinen Molekülen enthalten. Beachten Sie die serielle oder andere Identifikationsnummer der Quellplatten. Um die Kondensation auf den Platten zu minimieren, tauen Sie in einer Entfremdungskammer, die Eine Driektion enthält.

Drehen Sie die Platten in einer Tischzentrifuge mit einem Multi-Well-Plattenadapter kurz nach unten. Entfernen Sie das Aluminium-Dichtungsband von der Quellplatte. Verdünnen Sie die Verbindungen in der Quellplatte mit DMSO auf die gewünschte Konzentration. In diesem Protokoll verwenden wir eine 0,5-Millimolar-Endkonzentration und fügen 4,75 Mikroliter DMSO hinzu, um die 10 Millimollar-Lagerplatte zu verdünnen.

Wenn die Embryonen in der 96-Well-Platte das gewünschte Stadium erreichen, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 2,5 Mikroliter Verbindungen von den Quellplatten in die Empfängerplatten zu übertragen, die die Embryonen enthalten. Bedecken Sie die Platten, die jetzt die Embryonen und Verbindungen enthalten, mit Deckeln und notieren Sie die Identifikationsnummer der Quellplatten auf den Embryoplatten. Mischen Sie die Platten durch sanftes Wirbeln und legen Sie sie in einen 28,5 Grad Celsius Inkubator. Bedecken Sie jede Quellplatte mit ungenutzten kleinen Molekülen mit Aluminium-Dichtungsband und legen Sie sie in einen Minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.

Vor der Durchführung des visuellen Bildschirms, formulieren Sie ein bestimmtes Trefferkriterium. Zum Beispiel in einem Bildschirm für kleine Molekülinhibitoren der Vorhirnentwicklung, kann ein Treffer eine Verbindung sein, die den Verlust des Vorderhirns verleiht. Abwesenheit von Augen ist ein einfacher visueller Indikator für den Verlust des Vorderhirns und erfordert keine Fluoreszenz zum Assay.

Zu gewünschten Zeiten in der Entwicklung entfernen Sie die 96-Well-Platten, die zusammengesetzt behandelte Embryonen enthalten, aus dem Inkubator und untersuchen sie jeweils gut unter einem Stereomikroskop. Beim Screening auf kleine Molekülinhibitoren der Vorhirnentwicklung untersuchen Sie Platten nach 28 Stunden auf Den Verlust des Auges als Marker der Vorhirnentwicklungshemmung. Zeichnen Sie die Identität der Platte und die gute Lage für jeden Brunnen auf, in dem mindestens 3 von 5 Embryonen den vorgeschriebenen Hit-Phänotyp aufweisen.

Legen Sie die 96-Well-Platte wieder in den Inkubator. Bestätigen Sie den Verlust von Augen und Vorhirn nach 48 Stunden. Obwohl die Embryonen keinen Vorhirn haben, überleben sie mindestens vier Tage. Bestätigen Sie einen potenziellen Treffer durch erneutes Testen der Wirkung der Verbindung in mehreren Dosen. Für jede Dosis werden 10 Embryonen in 0,5 Millilitern E3-Medien in einem 48-Well-Plattenformat getestet.

Der Zeitpunkt der zusammengesetzten Addition für die erneute Prüfung sollte mit dem des ursprünglichen Screenings identisch sein. Ein Treffer wird bestätigt, wenn der ausgelöste Phänotyp auf reinabhängige Weise auf erneute Tests der Verbindung reproduziert wird. Schließlich identifizieren Sie die Treffermasse aus der Datenbank der kleinen Moleküle in der chemischen Bibliothek.