Эмбрион на основе химической токсичности экран: Оценка воздействия на развитие эмбрионов зебры

- Начните с добавления 5 эмбрионов в E3 среды к каждому хорошо 96-хорошо пластины, и удалить избыток среды с пипеткой. Добавить E3 среды, содержащей канамицин в каждой хорошо, чтобы предотвратить загрязнение. Пусть эмбрионы растут при 28 градусов по Цельсию.

Разбавить соединение интереса с соответствующим растворителем, таких как DMSO, чтобы подготовить несколько концентраций или доз, и проверить влияние каждой дозы на развивающихся эмбрионов. Как только эмбрионы достигают желаемой стадии, пипетка каждого стокового раствора в отдельных скважинах. Обложка пластины с крышкой и осторожно закружить его, чтобы смешать содержимое. Пусть эмбрионы в скважине пластины расти при 28 градусов по Цельсию.

В нужное время в эмбриональном развитии поместите пластину колодец под подходящий микроскоп для изучения фенотипа эмбрионов. Вы можете наблюдать фенотипы, такие как потеря глаз, задержка роста или потеря меланоцитов в развивающихся эмбрионах.

- Небольшие молекулы библиотеки, как правило, поставляются в 96-хорошо источник пластины с каждым соединением, хранящимся в DMSO в качестве 10 миллимоляонных запасов. Около 60 минут до эмбрионов достичь желаемой стадии, оттепель соответствующее количество 96-хорошо пластин, содержащих aliquots малых молекул. Принять к сведению серийный или другой идентификационный номер исходных пластин.

Кратко спина вниз пластины в столешницу центрифуги оснащены мульти-хорошо пластины адаптер. Удалить алюминиевой герметизации ленты из исходных пластин. Использование 12-канал пипетки, разбавить соединения в источнике пластины к желаемой концентрации с DMSO. В этом протоколе, мы используем 0,5 миллимолярной окончательной концентрации и добавить 4,75 микролитров DMSO для разбавления 10 миллимолярной пластины.

Когда эмбрионы в пластине 96-колодец достигают желаемой стадии, используйте 12-канальную пипету для переноса 2,5 микролитров соединений из исходных пластин в пластины-реципиенты, содержащие эмбрионы. Обложка пластин, в настоящее время содержащие эмбрионы и соединения с крышками и записывать идентификационный номер исходных пластин на эмбрион пластин. Смешайте пластины, мягко закрученного, и поместите их в 28,5 градусов по Цельсию инкубатор. Обложка каждой источник пластины, содержащей неиспользованные небольшие молекулы с алюминиевой герметизации ленты и место в минус 80 градусов по Цельсию морозильник для длительного хранения.

Перед выполнением визуального экрана сформулируйте конкретный критерий попадания.Например, на экране для малых молекул ингибиторы развития forebrain, удар может быть соединением, которое дает потерю forebrain. Отсутствие глаз является легким визуальным показателем потери forebrain и не требует флуоресценции для анализа.

В нужные моменты в развитии, удалить 96-хорошо пластин, содержащих соединения обработанных эмбрионов из инкубатора и изучить каждый хорошо под стерео микроскопом. При скрининге на небольшие ингибиторы молекулы развития предпевов, изучить пластины на 28 часов для потери глаза в качестве маркера ингибирования развития предплин. Запись личности пластины и хорошо расположение для любого хорошо, в котором по крайней мере 3 из 5 экспонатов

Поместите 96-хорошо пластины обратно в инкубатор. Подтвердите потерю глаз и forebrain на 48 часов. Даже если эмбрионы не будут иметь forebrain, они доживут до по крайней мере четыре дня. Подтвердить потенциальный удар путем повторного тестирования воздействия соединения в нескольких дозах. Для каждой дозы, 10 эмбрионов проверяются в 0,5 миллилитров E3 средств массовой информации в формате 48-колодец пластины.

Сроки добавления соединения для повторного тестирования должны быть идентичны первоначальному скринингу. Хит подтверждается, когда вызываемый фенотип воспроизводится в дозе зависимой манере при повторном тестировании соединения.