Embryobasert kjemisk toksisitetsskjerm: Vurdere effekter på å utvikle sebrafiskembryoer

- Begynn med å tilsette 5 embryoer i E3 medium til hver brønn av en 96-brønns plate, og fjern overflødig medium med en pipette. Tilsett E3 medium som inneholder kanamycin i hver brønn for å forhindre forurensning. La embryoene vokse ved 28 grader Celsius.

Fortynn forbindelsen av interesse med et passende løsningsmiddel, for eksempel DMSO, for å forberede flere konsentrasjoner eller doser, og test effekten av hver dose på å utvikle embryoer. Når embryoene når ønsket stadium, pipette hver lagerløsning i individuelle brønner. Dekk platen med et lokk og virvle det forsiktig for å blande innholdet. La embryoene i brønnplaten vokse ved 28 grader Celsius.

På ønsket tidspunkt i embryonal utvikling, plasser brønnplaten under et egnet mikroskop for å undersøke embryoenes fenotype. Du kan observere fenotyper som tap av øyne, forsinket vekst eller tap av melanocytter i de utviklende embryoene. I følgende protokoll vil vi teste et sammensatt bibliotek for små molekylhemmere av forebrain utvikling.

- Små molekylbiblioteker leveres vanligvis i en 96-brønns kildeplate med hver forbindelse lagret i DMSO som en 10 millimolarbestand. Ca. 60 minutter før embryoene når ønsket stadium, tine et passende antall 96-brønnsplater som inneholder aliquots av små molekyler. Legg merke til serienummeret eller annet identifikasjonsnummer på kildeplatene.

Spinn kort ned platene i en bordplate sentrifuge utstyrt med en multi-brønns plateadapter. Fjern aluminiumsforseglingstapen fra kildeplaten. Bruk en 12-kanals pipette, fortynn forbindelsene i kildeplaten til ønsket konsentrasjon med DMSO. I denne protokollen bruker vi en 0,5 millimolar sluttkonsentrasjon og tilsett 4,75 mikroliter DMSO for å fortynne den 10 millimolar endelige konsentrasjonen og tilsett 4,75 mikroliter DMSO for å fortynne den 10 millimolar endelige konsentrasjonen.

Når embryoene i 96-brønnsplaten når ønsket stadium, bruk en 12-kanals pipette for å overføre 2,5 mikroliter forbindelser fra kildeplatene til mottakerplatene som inneholder embryoene. Dekk platene som nå inneholder embryoer og forbindelser med lokk og registrer identifikasjonsnummeret til kildeplatene på embryoplatene. Bland platene ved å virvle forsiktig, og legg dem i en 28,5 grader Celsius inkubator. Dekk hver kildeplate som inneholder ubrukte små molekyler med aluminiumsforseglingstape og legg dem i en minus 80 grader Celsius fryser for langsiktig lagring.

Før du utfører den visuelle skjermen, formulerer du et bestemt treffkriterium. For eksempel, i en skjerm for små molekylhemmere av forebrain-utvikling, kan en hit være en forbindelse som gir tap av forebrain. Fravær av øyne er en enkel visuell indikator på tap av forebrain og krever ingen fluorescens til analyse.

På ønskede tidspunkter i utviklingen, fjern de 96-brønns platene som inneholder sammensatte behandlede embryoer fra inkubatoren og undersøk hver brønn under et stereomikroskop. Når du screener for små molekylhemmere av forebrain utvikling, undersøk plater på 28 timer for tap av øyet som en markør for forebrain utviklingshemming. Registrer identiteten til platen og brønnplasseringen for enhver brønn der minst 3 av 5 embryoer viser den foreskrevne fenotypen.

Plasser 96-brønnsplaten tilbake i inkubatoren. Bekreft tap av øyne og forebrain på 48 timer. Selv om embryoene ikke vil ha en forebrain, vil de overleve i minst fire dager. Rekonfirm et potensielt treff ved å teste effekten av forbindelsen på flere doser. For hver dose testes 10 embryoer i 0,5 milliliter E3-medier i et 48-brønns plateformat.

Tidspunktet for sammensatt tillegg for retesting bør være identisk med den opprinnelige screeningen. Et treff bekreftes når den fremkalte fenotypen reproduseres på en doseavhengig måte ved retesting av forbindelsen. Til slutt, identifiser treffforbindelsen fra databasen med små molekyler i det kjemiske biblioteket.