Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Iniziare aggiungendo 5 embrioni in mezzo E3 a ciascun pozzo di una piastra da 96 po' e rimuovere il mezzo in eccesso con una pipetta. Aggiungere il mezzo E3 contenente kanamicina in ogni pozzo per prevenire la contaminazione. Lasciare crescere gli embrioni a 28 gradi Celsius.
Diluire il composto di interesse con un solvente appropriato, ad esempio DMSO, per preparare diverse concentrazioni o dosi e testare l'effetto di ciascuna dose sugli embrioni in via di sviluppo. Una volta che gli embrioni raggiungono lo stadio desiderato, pipettare ogni soluzione stock in singoli pozzi. Coprire la piastra con un coperchio e ruotarla delicatamente per mescolare il contenuto. Lasciare che gli embrioni nella piastra del pozzo crescano a 28 gradi Celsius.
Al momento desiderato nello sviluppo embrionale, posizionare la piastra del pozzo al microscopio adatto per esaminare il fenotipo degli embrioni. È possibile osservare fenotipi quali perdita di occhi, crescita ritardata o perdita di melanociti negli embrioni in via di sviluppo. Nel seguente protocollo testeremo una libreria composta per piccoli inibitori molecolari dello sviluppo della proebraina.
- Le librerie di piccole molecole sono tipicamente fornite in una piastra sorgente di 96 pozzi con ogni composto immagazzinato in DMSO come stock di 10 millimolare. Circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungano lo stadio desiderato, scongelare un numero appropriato di piastre da 96 possedimenti contenenti aliquote di piccole molecole. Prendere nota del numero seriale o di altro tipo delle piastre di origine. Per ridurre al minimo la condensa sulle piastre, scongelare in una camera di essiccazione contenente drierite.
Far girare brevemente le piastre in una centrifuga da tavolo dotata di un adattatore a piastre multi-pozzo. Rimuovere il nastro di tenuta in alluminio dalla piastra di origine. Utilizzando una pipetta a 12 canali, diluire i composti nella piastra di origine alla concentrazione desiderata con DMSO. In questo protocollo utilizziamo una concentrazione finale di 0,5 millimolare e aggiungiamo 4,75 microlitri di DMSO per diluire la piastra di serie da 10 millimolare.
Quando gli embrioni nella piastra a 96 po 'raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare una pipetta a 12 canali per trasferire 2,5 microlitri di composti dalle piastre di sorgente nelle piastre riceventi contenenti gli embrioni. Coprire le piastre contenenti embrioni e composti con coperchi e registrare il numero di identificazione delle piastre di origine sulle piastre embrionale. Mescolare le piastre ruotandole delicatamente e posizionarle in un'incubatrice di 28,5 gradi Celsius. Coprire ogni piastra di sorgente contenente piccole molecole inutilizzate con nastro adesivo in alluminio e posizionarle in un congelatore meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.
Prima di eseguire lo schermo visivo, formulare uno specifico criterio di hit. Ad esempio, in uno schermo per inibitori di piccole molecole dello sviluppo del proencefalo, un colpo può essere un composto che conferisce la perdita del proencefalo. L'assenza di occhi è un facile indicatore visivo della perdita di proencefalo e non richiede fluorescenza per il test.
Nei momenti desiderati in fase di sviluppo, rimuovere dall'incubatore le piastre a 96 po' contenenti embrioni trattati composti ed esaminarli bene al microscopio stereo. Durante lo screening per piccoli inibitori molecolari dello sviluppo di proebrain, esaminare le piastre a 28 ore per la perdita dell'occhio come marcatore di inibizione dello sviluppo del proebrain. Registrare l'identità della piastra e la posizione del pozzo per qualsiasi pozzo in cui almeno 3 embrioni su 5 presentano il fenotipo di successo prescritto.
Riposizionare la piastra di 96 po' nell'incubatrice. Riconfermare la perdita di occhi e professbraina a 48 ore. Anche se gli embrioni non avranno un probrain, sopravviveranno ad almeno quattro giorni. Riconfermare un potenziale colpo ritestando gli effetti del composto a diverse dosi. Per ogni dose, 10 embrioni vengono testati in 0,5 millilitri di mezzi E3 in formato piastra da 48 pomeriggi.
La tempistica dell'addizione composta per la riprova dovrebbe essere identica a quella dello screening originale. Un colpo viene confermato quando il fenotipo suscitato viene riprodotto in modo dipendente dalla dose al momento della nuova prova del composto. Infine, identificare il composto colpito dal database di piccole molecole nella libreria chimica.
