Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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먼저 차가운 지하 멤브레인 매트릭스를 유리 바닥 접시에 붓고 파이펫 팁으로 고르게 펴보습니다. 멤브레인이 섭씨 37도에서 고화되어 이산화탄소를 지속적으로 공급하게 하십시오. 형광 표지된 암세포를 트립시프하여 플레이트 표면에서 분리하고 배양 배지에서 다시 분리합니다.
이러한 재중단 된 세포를 원상 관으로 옮기고 회전합니다. 상체를 제거하고 배양 배지에서 세포를 다시 중단합니다. 계산 후, 원하는 수의 세포와 지하 매트릭스를 포함하는 이 세포 현탁액을 동일한 비율로 혼합한다.
부드럽게 고화 된 지하 막 매트릭스 코팅 접시에 세포 매트릭스 혼합물을 판화. 세포 매트릭스 혼합물이 이산화탄소의 지속적인 공급과 함께 섭씨 37도에서 고화시키도록 하십시오. 혼합물이 고화되면, 접시에 배양 매체를 추가하고 원하는 기간 동안 배양한다.
암세포는 액틴이 풍부한 막 돌출부를 형성하고, 세포외 매트릭스를 저하시키기 위해 프로테아제를 방출하여 행렬을 침범할 수 있다. 돌출을 형성하는 세포를 분석하기 위해 다른 시간 간격으로 형광 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 실시예 프로토콜에서, 우리는 침략 과정을 연구하기 위해 3D 지하 막 매트릭스에 유방암 세포를 배양할 것입니다.
문화 절차를 시작하기 전에 지하 멤브레인 매트릭스, P200 파이펫 및 파이펫 팁을 하룻밤 동안 얼음에 4도에 놓습니다. 다음 날, 얼음처럼 차가운 200 마이크로리터 파이펫 의 끝을 사용하여 공초점 번호 1 유리 바닥 접시의 바닥에 나선형 패턴으로 매트릭스의 50 마이크로 리터를 확산시다. 그런 다음 37°C의 세포 배양 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 넣고 30분 이상 조리합니다.
매트릭스가 고화되고있는 동안, 트립시니화 70% 받는 사람의 80% 수렴 100 밀리미터 두께의 세포. 세포가 분리되기 시작하면, 10 밀리리터의 배지로 트립신을 비활성화한 다음 세포 현탁액을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨넣습니다.
100 Gs와 섭씨 4도에서 3 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 세포가 회전하는 동안, 지하 막 매트릭스의 접시 당 하나의 1 밀리리터 미세 센심 분리튜브에 매트릭스의 50 마이크로 리터를 알리쿼트 얼음에 튜브를 배치합니다. 세포가 회전을 마쳤을 때, 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네탄을 흡인한 다음 1 밀리리터의 매체에서 세포를 재일시 중단하고 계산합니다.
다음으로, 새로운 마이크로센심분리기 튜브로 2.5배 10회 10회 를 전송하여, 50마이크로리터의 최종 부피로 미디어로 세포 현탁액을 토핑한다. 그런 다음 1:1 비율로 세포에 얼음 차가운 지하 막 매트릭스 50 마이크로리터를 추가하여 100 마이크로리터의 최종 부피를 위해. 매트릭스를 응고된 지하 막 매트릭스에 세포 혼합물을 부드럽게 플레이트하고 세포 배양 배양기내의 매트릭스에 세포가 내장되도록 한다.
30분 후, 매트릭스를 2밀리리터의 미디어로 덮고 접시를 인큐베이터에 다시 넣고 실험 기간 동안 매일 미디어를 변경합니다. 실험 기간 동안 매일 1회 광 현미경의 10배 목표를 사용하여 지하 막 매트릭스에 매달린 식민지의 20개의 차동 간섭 대비 이미지를 채취한다. 맹목적으로 이미지를 분석하여 세포 식민지 의 형성을 결정합니다. 식민지는 세포의 스페로이드에서 하나 이상의 투영이 관찰되는 경우 stellate 것으로 간주됩니다.
