3D Культура Подвал Мембрана Анализ: Культивирование раковых клеток на 3D Подвал Мембрана Белковая матрица для изучения вторжения клеток

Во-первых, залить холодной мембраны подвала матрицы в стеклянном дне блюдо и равномерно распределить его с наконечником пипетки. Пусть мембрана затвердевет при 37 градусах цельсия, с непрерывным запасом углекислого газа. Трипсинизировать флуоресцентно помеченные раковые клетки, чтобы отделить их от поверхности пластины и повторно использовать их в среде культуры.

Перенесите эти повторно натученные клетки в коническую трубку и вращайся. Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в среде культуры. После подсчета, смешать эту подвеску клетки, содержащую нужное количество клеток с подвальной матрицы в равном соотношении.

Аккуратно пластины клеточной матрицы смеси на затвердевую мембрану подвала матрицы покрытием блюдо. Пусть смесь клеточной матрицы затвердевет при 37 градусах по Цельсию, с непрерывным запасом углекислого газа. После того, как смесь затвердевает, добавить культуру среды блюдо и инкубировать его на желаемый период.

Раковые клетки могут образовывать богатые актинами мембранные выступы и высвобождать протеи, чтобы ухудшить внеклеточную матрицу, тем самым вторгаясь в матрицу. Поместите блюдо под флуоресцентный микроскоп с разными временными интервалами для анализа клеток, образующих выступы. В примере протокола, мы будем культуры раковых клеток молочной железы на 3D мембранной матрицы подвала для изучения процесса вторжения.

Перед началом процедуры культуры, поместите матрицу мембраны подвала, P200 пипетку и пипетку советы на льду на ночь, при 4 градусах по Цельсию. На следующий день используйте кончик ледяной 200-микролитровой пипетки, чтобы распределить 50 микролитров матрицы по спиральной схеме над дном блюда из стекла No1. Затем поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию, с 5% углекислого газа, по крайней мере 30 минут.

В то время как матрица проходит затвердевание, трипсинизировать 70% до 80% стечения 100-миллиметровой пластины клеток. После того, как клетки начали отделяться, инактивировать трипсин с 10 миллилитров среднего, а затем передать клеточной подвески в 15-миллилитровую коническую трубку.

Центрифуга клетки в течение трех минут при 100 Gs и 4 градусов по Цельсию. В то время как клетки вращаются вниз, aliquot 50 микролитров матрицы в один 1 миллилитр микроцентрифуг трубки на блюдо мембранной матрицы подвала и место труб на льду. Когда клетки закончили вращаться, аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, а затем повторно использовать клетки в 1 миллилитр средств массовой информации и считать их.

Далее, передача 2,5 раза 10 в 4-й клетки в новую трубку микроцентрифуг, долива от подвески клетки со средствами массовой информации до конечного объема 50 микролитров. Затем добавьте 50 микролитров ледяной мембранной матрицы в клетки в соотношении 1:1, для конечного объема в 100 микролитров. Аккуратно пластины матрицы клеточной смеси на затвердевую мембранную матрицу подвала и позволяют клеткам стать встроенными в матрицу в инкубаторе клеточной культуры.

Через 30 минут накройте матрицу 2 миллилитровами мультимедиа и поместите блюдо обратно в инкубатор, меняя мультимедиа каждый день на время эксперимента. Используйте 10x цель светового микроскопа один раз в день в течение всего эксперимента, чтобы принять 20 дифференциальных интерференционных контрастных изображений колонии приостановлено в матрице мембраны подвала. Проанализируйте изображения вслепую, чтобы определить образование клеточной колонии stellate. Колония считается stellate, если один или несколько проекций из сфероида клеток наблюдаются.