DNA-vektor-baserad RNA-interferens för att studera genfunktion i Cancer

1. Generering av shRNA Konstrukt

1. Identifiera en siRNA-målsekvens (20-23 nukleotider) baserat på tidigare offentliggjorda kriterier ⁶ eller använder en webbaserad algoritmen server, till exempel "siRNA Target Finder" från Ambion och GenScript.
2. Syntetisera oligonukleotider baserade på utformningen i figur 1 och exempel sekvenser i Tabell 1. Utföra PCR-amplifiering med användning av oligonukleotider P1 och P2 (30 cykler av denaturering vid 94 ° C under 30 sekunder, annealing vid 60 ° C under 30 sek, och töjning vid 72 ° C under 30 sek) och en plasmid som bär den U6 eller H1 promotor som mall. Rena PCR-produkten med användning av en PCR-reningskolonn. Smälta det genom BamHI och Hindlll och rena den digererade DNA: t med användning av en PCR-reningskolonn. Glödga oligonukleotider P3 och P4 (2,5 pmol / | il av var och en i 100 | il av 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) genom kokning under 5 min och kyldes långsamt ned till rumstemperatur. Smälta en lentiviral VECtor, såsom den som beskrivs i Figur 2A, genom BamHI och EcoRI, och utföra gel-rening.
3. Utföra en 3-fragmentet ligering med BamHI / EcoRI-digererad-vektor, en BamHI / Hindlll-klippta PCR-fragmentet och ett par av hybridiserade oligonukleotider (som bildar Hindlll och EcoRI-ställena vid de två ändarna) vid en 1:10:10 molförhållande (figur 1).
4. Transformera effektiv kompetent E. coli DH5a-celler med användning av det ligerade produkten. Sålla kolonierna med hjälp av oligonukleotider P5 (i vektorn) och P6 (i H1 eller U6 promotor). ⁷
5. Framställa plasmid-DNA från de positiva kolonierna med en kommersiell kit och bekräfta närvaron av insättningen genom BamHI / EcoRI-digerering och DNA-agaros elektrofores. Sekvensen den region som innehåller promotorn och shRNA användning av oligonukleotid P5.
6. Använd plasmid DNA Midi-eller Maxi-beredning kit (endotoxinfritt är att föredra) för att förbereda lentivirus DNA bär shRNA uttrycketkassetten. Bestämma DNA-koncentrationen genom att mäta absorptionen vid 260 nm. Kontrollera DNA renheten med hjälp av 260 nm/280 nm-förhållande och se till att den faller i intervallet 1,8 till 2,0. Kontrollera lentivirus plasmiden integriteten med agarosgelelektrofores. DNA för transfektion ska vara super-lindas.

2. Lentivirus Transfektion

Försiktighetsåtgärder: Lentiviral vektorer härrör från humant immunbristvirus-1 (HIV-1) genomet och replikering inkompetent. De har använts i stor utsträckning genleverans till följd av förmågan att infektera både delande och icke-delande celler. Men två stora risker finns i studierna med lentivirus. (1) Potentialen för generering av replikationskompetent lentivirus. Denna risk kan minskas kraftigt om den tredje generationen lentiviral systemet används. (2) Potentialen för onkogenes. Denna risk kan förvärras om som insatserna är onkogena eller undertrycka tumörsuppressorer.Forskningsverksamhet är involverade i HIV-baserade lentivirus bör följa de "biosäkerhet överväganden för forskning med Lentiviral Vektorer" av NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) och kräver ett godkännande från biosäkerhet kommittén av en forskares institution. Generellt inneslutning förbättrad skyddsnivå-2 (BSL-2) krävs för laboratoriet inställningen om lentivirala vektorer används.

1. Plattan 4 x 10 ⁶ HEK 293T-celler med komplett DMEM-medium (DMEM matas med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin) i 10 cm skålar och kulturen över natten vid 37 ° C i en _5% CO2 inkubator. Ersätta mediet med 5 ml av förvärmd Opti-MEM I Reduced Serum media (Invitrogen).
2. Framställ Lösning A: 10 | ig shRNA-innehållande lentiviral vektor 5 pg vardera av den tredje geneation lentivirus förpackningar plasmider (tillagas med hög renhet, de tre förpackningar plasmider innefattar VSV-G: för ett kuvert protein, pRSV-Rev: för rev och pMDLg / pRRE: för gag / pol, som är väsentliga för lentivirus förpackning), 36 il 2M _CaCl2 och 300 | il sterilt vatten.
3. Framställ Lösning B: 300 | il av 2 x HEPES-buffrad saltlösning (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na-HPO _{2 4,} pH justerades till 7,12 med 0,5 N NaOH och steriliserades genom ett 0,22 ^ m filter).
4. Sakta sjunka lösning A i lösning B under bubbling av luft genom Lösning B med en pipett. Lämnar röret vid rumstemperatur under 30 minuter.
5. Långsamt släppa de blandade lösningarna A / B in i HEK 293T-cell odlingsskål som framställts i steg 2,1 och inkubera vid 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator} under 4-6 timmar.
6. Ersätta mediet med 7 ml av komplett DMEM-medium. Efter 24 h tillsätt ytterligare 5 ml av komplett DMEM-medium. Skörda mediet fortsaining lentivirus efter ytterligare 24 h i kultur.
7. Snurra mediet vid 1500 rpm, rumstemperatur under 10 minuter. Filtrera supernatanten med användning av en 0,45 | im filter och spinna den genomströmmande mediet innehållande lentivirus genom ultracentrifugering vid 25.000 varv per minut (motsvarande till 125.000 x g med en SW28-swinging bucket rötor, Beckman ultracentrifug XL-90), 4 ° C under 90 minuter. Dekantera supernatanten till en behållare med 5% blekmedel (slutlig koncentration).
8. Resuspendera pelleten lentivirus i 0,5-1,0 ml kall PBS och göra lentivirus alikvoter i 50-100 | il per rör. Förvara dem vid -80 ° C.
9. Titern av lentivirus kan bestämmas genom kommersiella kit (såsom QuickTiter Lentivirus Kvantifieringskit från Cell Biolabs, Inc.), genom en realtids-PCR-protokoll ^8, eller genom bestämning av samuttryckt fluorescerande markör med användning av fluorescensmikroskopi eller flödescytometri . Typiskt kan en 10-cm odlingsplatta producera ca 0,5-1,0 x 10 ⁸ infektionsmittsamma enheter (lE).

3. Infektion och karakterisering av infekterade celler

1. Utsäde de celler som skall infekteras i 2 ml komplett medium i en 6-brunnsplatta med 30-40% konfluens (ca 5-8 x 10 ^5-celler, beroende på cellstorlekar). Odla cellerna över natten vid 37 ° C i en _5% CO2 inkubator.
2. Ersätta mediet med 1 ml färskt medium innehållande 8 | ig / ml polybren (Sigma, Cat # H9268) eller 5 | ig / ml protamin (Sigma, Cat # P4020).
3. Bestämma en lämplig multiplicitet av infektion (MOI) intervall ⁹ för en särskild cellinje med användning av lentivirus med fluorescerande markör. Beräkna eller empiriskt bestämma den mängd av lentivirus som skall användas för att infektera cellinjen. Sakta släppa lentivirus i plattan och skaka den försiktigt i 10 sekunder.
4. Inkubera plattan vid 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator} under 6 h och sedan ersätta mediet med normal komplett medium.
5. Minst två days efter infektion, kontrollera cellerna med hjälp av fluorescens mikroskopi för lentivirus uttrycker fluorescerande markörer och / eller lägga till motsvarande antibiotikum till mediet för lentivirala vektorer som uttrycker gener för antibiotikaresistens. För en inducerbar vektor, såsom en Tet-On-systemet (fig 2), odling av cellerna i medium som framställts med tetracyklin-fri FBS. Dela cellerna 2-3 dagar efter infektion. Ta en del av cellerna för att testa knockdown inducerbar gen genom att odlas i mediet matas med och utan 1,5 ^ g / ml doxycyklin (Dox) i ≥ 2 dagar.
6. Kontrollera genen knockdown med Western blot, Real-Time PCR eller immunfärgning ≥ 2 dagar efter infektion, 2 dagar efter antibiotikaselektion, eller (för en Tet-On inducerbara system) ≥ 2 dagar efter Dox tillsats.
7. Utnyttja olika strategier (såsom cellproliferation analyser, mjuka agar studier kultur, analyser migration, analyser invasion och tumör studier bildandet) för att bestämma effekterna av målgenen kNockdown på malignitet hos cellerna.

4. Xenograft Mouse modellstudie

1. Rengör alla ytor för mus bedövning och injektion med 70% etanol för att förhindra infektion hos möss. Bedöva atymiska nakna möss (NCI-Frederick) med användning av 2% isofluran blandas med syre i en anestesi induktionskammare 10 min före cellympning. Bibehålla anestesi med användning av 1% isofluran blandad med syre genom en noskon. Utför detta steg i ett rum med god ventilation och bifoga isofluran asätare filter för att induktion kammaren.
2. Propagera de celler som bär shRNAs. Använda tetracyklin-fritt medium för Tet-On inducerbara vektorer. Trypsinisera cellerna och återsuspendera dem i komplett medium innehållande 50% Matrigel. Positionera de nakna mössen på en värmedyna (30 ° C) och injicera 200 jil av cellerna (1-10 x 10 ^6, beroende på malignitet av cellerna) i mössen med 1-2 injektionsställen per mus. Använd sprutor med 25.5-nålar för subkutan injektion och 28-30 nålar spårvidd för ortotopisk injektioner.
3. För konstitutivt shRNA vektorer, utnyttjar 2 grupper av möss som injicerats med celler som uttrycker shRNA målgenen och en kodad shRNA. För Tet-On-vektorer inducerbara shRNA, utnyttjar 4 grupper av möss som injicerats med celler som bär den shRNA målgenen och en kodad shRNA, försedd med normalt vatten och Dox (1,5 mg / ml) innehållande vatten (2 shRNAs x 2 behandlingar = 4 grupper) . Byt Dox som innehåller vatten två gånger i veckan.
4. Övervaka längden och bredden hos tumörerna varje vecka eller varannan vecka med en digitalt skjutmått och beräkna tumörvolymer (V) med formeln V = 1/2 (längd x bredd ^{2) 10.} Se till att tumörvolymen inte överstiger riktlinjerna i den institutionella ACUC (såsom 10% av kroppsvikten). Euthanize varje mus med ett protokoll som godkänts av den institutionella ACUC Om det visar några tecken på omfattande sårbildning eller nekros, uppenbara infection, okontrollerad blödning eller slutstadiet sjukdom.
5. Tumörtillväxt och metastas kan övervakas för de ympade tumörceller som uttrycker en bioluminiscent markör ^11, såsom eldflugeluciferas. Rengör alla ytor för mus bedövning och bildbehandling med 70% etanol för att förhindra infektion hos möss. Bedöva mössen såsom beskrivits i steg 4.1. Injicera luciferin (150 mg / kg) intraperitonealt. Placera mössen in i en desinficerad avbildning kammare i ett kommersiellt avbildning, såsom ett IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Slå på anestesi spaken för att upprätthålla anestesi med 1% isofluran blandat med syre. Genomföra detta steg i ett rum med god ventilation.
6. Ta den första bilden genom att exponera 5 min och kontrollera sin signal intensitet. Justera exponeringstiden för att erhålla bilder med optimal signal mot bakgrund. Bestämma avbildningstiden empiriskt, vilket är allmänt 1-5 min för subkutana tumörer.
7. Euthanize mössen med ett godkänt protokollav institutionella ACUC då tumörstorlekar når ca 1.000 mm ^3, eller som specificeras av ACUC riktlinjerna. Punktskatter på xenograft tumörer, väga dem och ta bilder. Behandla tumörprover för olika studier, såsom patologiska analyser för att avgöra tumörcellen morfologi, och Western blot och Real-Time PCR studier för att pröva genuttryck.

5. Representativa resultat

Detta protokoll användes för att studera effekterna av YY1 knockdown på xenograft tumörbildning i Firefly luciferas-uttrycker MDA-MB-231-celler (humana bröstadenokarcinomceller, Caliper Life Sciences) i atymiska nakna möss. Den shRNA Målsekvensen av humant YY1 är "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". En förvrängd sekvens "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" har också skapats för en kontroll (forts) shRNA, som inte har betydande likhet med alla kända utskrift. De oligonukleotider som användes för att göra Tet-On inducerbara shRNA konstruktioner, med YY1 som ett exempel, Visas i tabell 1. Som ett resultat erhölls två lentivirala vektorer, pLu-puro-Indu-YY1 shRNA och pLu-puro-Indu-kont shRNA konstruerat och de användes för att framställa lentivirus. Vi använde dessa lentivirus att individuellt infektera två MDA-MB-231 cell-kloner (kloner 1 och 3) som uttrycker både tetracyklin regulatorn (tetR) och eldflugeluciferas. Polyklonala cellpopulationer erhölls efter puromycinselektion. Figur 3A visar Dox-inducerad YY1 knockdown av dessa MDA-MB-231-celler infekterade med pLu-puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Vi använde sedan de polyklonala celler av klon 3 infekterats individuellt genom dessa inducerbara YY1 shRNA och forts shRNA lentivirus och observerade att YY1 utarmning reduceras invasivitet av MDA-MB-231-celler (Figur 3B). Western blot-analyser bekräftade Dox-inducerad YY1 tystande i MDA-MB-231-celler med indu-YY1 shRNA, medan celler som innehåller indu-kont shRNA inte visar denna effekt (figur 3C). Vi använde sedan dessa celler för xenograft musmodell studie. Jämfört med kontrollgrupperna visade möss som implanterats med de MDA-MB-231-celler med indu-YY1 shRNA och matas med Dox-innehållande vatten reduceras tumörbildning när visualiserades genom bioluminescens (figur 4A) och bestämdes genom tumörvikter (figur 4B ). YY1 tystande av dessa xenograft tumörer bekräftades genom Western blot-studierna som visas i figur 4C.

Figur 1. Schematiskt diagram för generering av en shRNA konstrukt och shRNA transkription. Primrarna P1 till P6 visas (se tabell 1 för exempel sekvenser). Pol III: RNA-polymeras III (d):. Digererad ände. Ritningen är inte skalenlig. Klicka här för att visa en större bild .

2 "src =" / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg "/>
Figur 2. Schematiskt diagram över (A) en lentivirusvektor och (B) mekanismen för Tet-On inducerbara H1 promotor för geners uttryck. Den lentivirala vektor rekonstrueras baserat på pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 promotor, UBC-Pr: Human ubiquitin C promotor; Puro: puromycin; TRE: svarar på tetracyklin element; Dox: doxycyklin. TetR: tetracyklin regulator. 5'LTR, 3'SIN-LTR och WRE är viktiga komponenter i en lentivirusvektor ^14.

Figur 3. Dox-inducerad YY1 ljuddämpning och dess inverkan på invasivitet av MDA-MB-231 celler. A. YY1-nivåer i två polyklonala cellpopulationer härledda från TetR-uttryckande kloner 1 och 3 som infekterats med pLu-puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus och odlades i frånvaro och närvaro av Dox. B. Boydenkammare-analys av MDA-MB-231 celler med inducerbara shRNAs. (* P <00,05 jämfört med övriga tre grupper). C. Representativa Western blöt av YY1 uttryck i dessa fyra cellpopulationer.

Figur 4. Effekterna av inducerad YY1 tystande på xenotransplantat tumörbildning genom MDA-MB-231-celler. A. Schematisk bild av cell implantation (vänster) och representativa självlysande bilder tagna av IVIS Imaging System på 4 veckor (till höger) efter cellympning. B. xenograft tumörvikter vid 4 veckor. * P ≤ 0,05. C. Western blöt av YY1 och β-aktin uttryck i xenografter av MDA-MB-231 celler med indu-YY1 shRNA i frånvaro och närvaro av Dox. Etiketter på toppen är namnen på enskilda möss.

Tabell 1. Syntetiserade oligonukleotider som används vid generering av shRNA konstruktioner. P1 och P6-sekvenser för mus-U6 och Tet-On inducerbara promotorer humana H1 är anordnade. Human YY1 används som ett exempel med en shRNA mål sekvens av GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. Sekvenserna är specifika för YY1 markeras. Två P2 sekvenser av YY1 är utformade för de två initiativtagarna, respektive. Den konstitutiva U6 / YY1 shRNA beskrevs tidigare ^15, medan den Tet-On H1/YY1 användes i detta protokoll. P5 är vektor-specifik och sekvensen för pLL3.7 ¹⁴ visas. Sekvenserna av restriktionsenzymer är understrukna, medan de sekvenser att hybridisera till de promotorer under PCR-amplifiering är kursiverad.

Detta protokoll beskriver en metod för att slå ner en gen med användning av shRNA och visualisera dess biologiska effekt med användning av bioluminescerande avbildning av tumörcelltillväxt in vivo. Målstället av en shRNA inte bör innehålla någon av de tre restriktionsställen (BamHI, Hindlll och EcoRI) användes för subkloning. I en sällsynt scenario när någon av dessa ställen är närvarande, kan en ytterligare restriktionsenzym användas för att ersätta den i generering av konstruktionen.

Flera viktiga steg i detta protokoll kommer att påskynda byggandet av shRNA Lentiviral vektorer. Först kan PCR-mall plasmiden innehållande U6 eller H1 promotor ha en annan gen för antibiotikaresistens (såsom kanamycin) från den lentivirala vektor (typiskt ampicillin). Detta kan reducera bakgrunden av transformation orsakad av mallen plasmiden. För det andra är det nödvändigt att använda kompetent E. coli-celler med hög effektivitet på transformation. Ett protokoll med kalium ennd manganjoner kan användas för att framställa kompetenta E. coli-celler med extremt höga kompetens ^12. Tredje, kan en selekterbar markör underlättar 3-fragmentet subkloning. Till exempel kan en lentiviral vektor konstrueras för att innehålla en expressionskassett för β-galaktosidas (LacZ) som kommer att ersättas genom insättning av PCR-fragmentet och glödgade P3/P4 oligonukleotider. I detta fall kommer rekombinanta plasmider med skären bildar vita kolonier, medan dessa utan skären blir blå när de utsätts för X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-galakto-pyranosid) .

Kvaliteten på lentivirala vektorer och de tre plasmider förpackningen är avgörande för en effektiv lentivirus produktion. En mycket ekonomisk och effektiv transfektion metod där kalciumfosfatutfällning har lämnats. Polyetylenimintyp ¹³ eller de flesta kommersiella transfektion reagens kan också användas i lentivirus produktionen. Om du vill använda en riktig MOI for-infektion, är det viktigt att bestämma de titrar av produceras lentivirus.

Möss i alla experimentella grupper bör hållas i samma rum för att eliminera deras dygnsrytm skillnaden som kan orsaka variation i bioluminiscens under xenograft tumöravbildning. Tillvägagångssätt av mus dödshjälp inkluderar CO ₂ kvävning och överdos av isofluoran och bör godkännas av den institutionella ACUC.