DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genfunktion durch den Einsatz von DNA-Vektor-basierter RNA-Interferenz zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst S-H-R-N-A-Konstrukte entworfen und generiert werden, die auf bestimmte Gene abzielen. Der zweite Schritt besteht darin, Lentiviren zu produzieren, die die SH-RNA-Expressionskassette tragen.

Dann werden stabile Zelllinien erzeugt, indem Zellen mit dem Lentivirus infiziert werden, und die mit dem Lentivirus infizierten Zellen werden in verschiedenen in vitro und in vivo Assays verwendet, um die Auswirkungen des Silencings des interessierenden Gens zu bestimmen. Letztendlich können die Ergebnisse abhängig von den verwendeten Assays Veränderungen in der Tumorgenizität der Zellen als Folge des Gen-Knockdowns durch die Verwendung von in vitro Proliferations-, Migrations- und Invasionsassays sowie von in vivo Xenotransplantat-Bildungsmodellen zeigen. Das Verfahren wird von Daniel Stowell, Ma Juan, vorgeführt, und Daniel ist Doktorand in meinem Labor, Ma Ma ist Techniker.

Chang ist Postdoktorand. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung zu beantworten, etwa ob ein bestimmtes Gen eine Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs spielt und für welche Aspekte dieser Prozesse es wichtig sein kann. Um mit dem Design und der Anordnung der Oligonukleotide auf der Grundlage der beschriebenen Kriterien zu beginnen, werden die beiden umgekehrten komplementären Oligos, die die Zielsequenz von 20 bis 23 Nukleotiden enthalten, im Zielgen verwendet.

Sie werden an den beiden Enden eco R one und Hindi drei Standorte bilden. Nachdem es ein geknietes Oligo war, enthält ein anderes Oligo eine umgekehrte komplementäre Sequenz zur Zielsequenz und deren drei Primzahlen. Neils an den drei Primzahlen des Promotors H 1 oder U 6 mit einem Upstream-Primer.

Verwenden Sie eine PCR, um ein Fragment zu erstellen, das BAM H eine und Hindi drei Stellen an beiden Enden aufweist. In der Zwischenzeit verdauen Sie den Lentivirus-Vektor und das PCR-Fragment. Führen Sie dann eine Drei-Fragment-Ligationsreaktion zwischen dem Vektor, dem PCR-Fragment und den Anil-Oligonukleotiden durch.

Bei einem molaren Verhältnis von eins zu 10 bis 10 molar erzeugt der resultierende Vektor die interessierende HRNA mit einer Hindi-Drei-Sequenz im Schleifenbereich. Wenn ein induzierbarer Vektor verwendet wird, hängt die HRNA-Produktion vom Vorhandensein eines Induktormoleküls wie Doxycyclin für das Tet-on-System ab. Transformieren Sie nun hocheffiziente, kompetente e coli DH Fünf-Alpha-Zellen mit dem ligierten Produkt und identifizieren Sie positive Vektoren mit einem koloniebasierten PCR-Screen.

Amplifizieren Sie ein Produkt, das den Vektor und die induzierbare Promotor-Ligationsstelle überspannt. Bereiten Sie Plasma-DNA aus den positiven Kolonien mit einem kommerziellen Kit vor. Bestätigen Sie dann das Vorhandensein des Inserts durch BAM H one und ECO R one Verdau und durch DNA-Agaroseelektrophorese.

Zusätzlich wird die Region, die den Promotor und S-H-R-N-A enthält, unter Verwendung des LIGA-Nukleotids P fünf sequenziert. Bereiten Sie mit einem endotoxinfreien MIDI- oder Maxi-Vorbereitungskit die Lentivirus-DNA vor, die die HRNA-Expressionskassette trägt. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration, indem Sie die Lichtabsorption bei 260 Nanometern messen, und stellen Sie die Reinheit des DN a sicher, indem Sie überprüfen, ob das Lichtabsorptionsverhältnis von 260 bis 280 Nanometern zwischen 1,8 und 2,0 liegt.

Lassen Sie schließlich das Lentivirus-Plasmid auf ein Aero-Gel laufen, um sicherzustellen, dass es S-gewickelt ist. Bereiten Sie sich vor der Transfektion auf die Transfektion vor, indem Sie zuerst langsam 0,9 Milliliter Lösung A in 0,9 Milliliter Lösung B fallen lassen, während Sie mit einer Pipette Luft durch Lösung B blasen. Dann die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden 0,6 Milliliter der Mischung langsam auf drei verschiedene 10 Zentimeter große Platten mit HEK 2 93 T-Zellen fallen gelassen.

Vier bis sechs Stunden später kehren die Zellen dann wieder in den Inkubator zurück. Ersetzen Sie das Medium durch sieben Milliliter vollständiges DMEM-Medium. Fügen Sie nach 24 Stunden fünf weitere Milliliter Medium hinzu und ernten Sie nach weiteren 24 Stunden das Medium, das das Lentivirus enthält.

Schleudere das geerntete Medium bei 1500 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45-Mikrometer-Filter. Schleudern Sie den Durchfluss durch Ultrazentrifugation durch Medium, das das Lentivirus enthält.

Defilling des Überstands in einen Abfallbehälter mit 5 % Bleichmittel. Resuspendieren Sie das Lentivirus-Pellet in einem halben bis einem Milliliter kaltem XPBS. Teilen Sie dann die Lentivirus-Lösung in 50 bis 100 Mikroliter Aliquote für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Bestimmen Sie schließlich den Titer des Lentivirus mit einer zuverlässigen Technik. In der Regel produziert eine 10-Zentimeter-Kulturschale 50 bis 100 Millionen infektiöse Einheiten, bevor sie mit der Zellinfektion fortfährt. Bestimmen Sie den MOI des lentiviralen Titers mit einem Kit oder R-T-P-C-R für dieses Verfahren.

Ein Trägheitsmoment unter vier wird empfohlen. Beginnen Sie damit, die zu infizierenden Zellen in einer Sechs-Well-Platte auf 30 bis 40 % Co-Flüssigkeit auszusäen und über Nacht zu kultivieren. Am nächsten Tag.

Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter frisches, mittelhaltiges Polyhirn oder Protamin. Fügen Sie dann zwischen einer und 2 Millionen IE hinzu. Ein Lentivirus, das einen fluoreszierenden oder einen antibiotischen Marker enthält.

Schütteln Sie die Platte langsam für 10 Sekunden, um sie zu mischen und sechs Stunden lang zu inkubieren. Ersetzen Sie nach sechs Stunden das Medium durch normales, vollständiges Medium und vermehren Sie die Zellen zwei Tage lang. Die Medien sollten keine Antibiotika oder Induktoren enthalten, unabhängig davon, welches Lentivirus nach zwei Tagen verwendet wird.

Fügen Sie das entsprechende Antibiotikum hinzu, wenn das Lentivirus einen Antibiotikamarker enthält. Geben Sie ebenfalls Induktor zu der Hälfte der Kulturen, wenn das Lentivirus induzierbar ist. Nachdem Sie die Zellen für zwei oder drei weitere Tage mit Antibiotika und Induktoren kultiviert haben, führen Sie eine westliche Blutanalyse durch, um den Knockdown des Zielgens vor der Xenotransplantat-Trypsin-Augen zu testen.

Die Zellen werden aus großen Zellkulturschalen entnommen und in einem Originalmedium, das 50%iges Matrigel enthält, resuspendiert. Es ist wichtig, die Krebszellen resuspendiert und in 50%Matrigel und der Spritze auf Eis zu halten. Andernfalls besteht die Gefahr, dass sich das Matrigel verfestigt und die Infektion darüber informiert werden muss.

Bereiten Sie die Operationsstelle vor, indem Sie sie gründlich mit 70%igem Ethanol reinigen und die Anästhesie mit hervorragender Beatmung und einem an der Induktionskammer angebrachten isof-Fluor-Scavenger-Filter durchführen. Betäuben Sie eine Thymus-Nacktmäuse drei bis fünf Minuten vor der Zellinokulation mit 2 % Fluor gemischt mit 1,5 % Sauerstoff. Halten Sie dann die Anästhesie mit 2% Fluor aufrecht, das durch einen Nasenkonus mit Sauerstoff gemischt wird.

Positionieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, das auf 30 Grad Celsius eingestellt ist. Laden Sie die Zellen in Spritzen mit 25 1/2 Gauge Nadeln für subkutane Injektionen oder 28 bis 30 Gauge Nadeln für orthotope Injektionen. Fünf Minuten nach Einleitung der Anästhesie an einer oder zwei Stellen injizieren Sie ein bis 10 Millionen Zellen in 200-Mikroliter-Boli.

Die Zellzahl hängt von der Bösartigkeit oder Aggressivität der Krebszellen ab. Für konstitutiv aktive Vektoren werden zwei Gruppen von Mäusen injiziert, wobei die Zellen entweder das Zielgen S-H-R-N-A oder ein verschlüsseltes S-H-R-N-A-Fortet auf Vektoren exprimieren. Verwenden Sie die gleichen beiden Gruppen und teilen Sie sie jeweils in Untergruppen ein, die in ihrem Wasser Induktor enthalten sind oder nicht.

Tauschen Sie die wasserhaltigen Dokumente zweimal pro Woche aus. Überwachen Sie das Volumen der Tumoren wöchentlich oder zweiwöchentlich mit einem C.Stellen Sie sicher, dass das Tumorvolumen den institutionellen oder A-CUC-Grenzwert nicht überschreitet, und euthanasieren Sie alle Tiere, die ausgedehnte Geschwüre, offensichtliche Nekroseinfektionen, unkontrollierte Blutungen oder Erkrankungen im Endstadium aufweisen. Um das Tumorwachstum und die Metastasierung über einen biolumineszierenden Marker zu überwachen, desinfizieren Sie den Arbeitsbereich und betäuben Sie die Mäuse in einer Bildgebungskammer mit Gasanästhesie.

Machen Sie zunächst eine zwei- bis fünfminütige Belichtung und überprüfen Sie die Signalintensität und passen Sie sie dann entsprechend an. Wenn die Tumorgröße 1000 Kubikmillimeter oder die institutionelle Größenbeschränkung überschreitet, euthanasieren Sie das Tier bei der Tötung, dokumentieren Sie die Tumorgröße und bewahren Sie sie für weitere Analysen auf. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Auswirkungen von Why Y one Knockdown auf die Bildung von Xenotransplantat-Tumoren von Luciferase-exprimierenden menschlichen Brust-Adenokarzinomzellen zu untersuchen, die in athyme Nacktmäuse implantiert wurden.

Die S-H-R-N-A-Zielsequenz von humanem YY one und einer verschlüsselten Kontroll-S-H-R-N-A, die keine signifikante Ähnlichkeit mit einem bekannten menschlichen Transkript aufwiesen, wurden beide getestet. Als Ergebnis wurden zwei lentivirale Vektoren konstruiert und zur Herstellung von zwei Lentiviren verwendet. Beide wurden verwendet, um zwei verschiedene Zellpopulationen zu infizieren, und es wurden polyklonale Zellpopulationen erhalten.

Nach reiner Mycin-Auswahl. Westliche Blutanalysen bestätigten, dass der DS in diesen infizierten Zelllinien einen YY-Eins-Knockdown induzierte. Als nächstes wurde die polyklonale Zellpopulation von Klon drei, der mit induzierbarem YY eins S-H-R-N-A infiziert wurde, und die Kontrolle. S-H-R-N-A.

LENTIVIREN wurden verwendet, um die Auswirkungen einer Depletion von YY one auf die Invasion zu testen. Wir beobachteten, dass eine Depletion von YY eine Verringerung der Invasivität der Zellen darstellte. Westliche Blutanalyse bestätigte, dass Ärzte YY one Silencing in Zellen mit dem indu YY one S-H-R-N-A induzierten, während Zellen, die Kontrolle enthielten.

S-H-R-N-A zeigte diesen Effekt nicht. Diese Zellen wurden dann in einer Xenotransplantat-Mausmodellstudie im Vergleich zu den Kontrollgruppen indu, YY one S-H-R-N-A implantierte Mäuse, die mit dem wasserhaltigen dos versorgt wurden, zeigten eine signifikant reduzierte Tumorbildung, wenn sie durch Biolumineszenz sichtbar gemacht wurden und wenn das Tumorgewicht wie erwartet gemessen wurde. YY one silencing in diesen Xenotransplantat-Tumoren konnte ohne weiteres durch Western Blot bestätigt werden.

Studien Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren gemäß den Sicherheitsüberlegungen des NIHB für die Forschung mit lentiviralen Vektoren extrem gefährlich sein kann: Für alle Laborumgebungen sind Verfahren der erhöhten Sicherheitsstufe B erforderlich.