DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion mittels RNA-Interferenz auf Basis von DNA-Vektoren zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst S-H-R-N-A-Konstrukte entworfen und erzeugt werden, die gezielt bestimmte Gene ansprechen. Der zweite Schritt besteht in der Herstellung von Lentivirus, das die SH-RNA-Expressionskassette trägt.

Anschließend werden stabile Zelllinien erzeugt, indem Zellen mit dem Lentivirus infiziert werden, und die mit dem Lentivirus infizierten Zellen werden in verschiedenen in-vitro- und In-vivo-Assays eingesetzt, um die Auswirkungen der Stilllegung des Gens von Interesse zu bestimmen. Letztendlich können die Ergebnisse – je nach verwendeten Assays – Veränderungen in der Tumorgenität der Zellen infolge der Gen-Reduktion zeigen, und zwar mithilfe von in-vitro-Proliferations-, Migrations- und Invasionsassays sowie In-vivo-Xenotransplantationsmodellen. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Daniel Stowell, ma Juan, wobei Daniel ein Doktorand in meinem Labor ist und Ma Ma eine technische Assistentin.

Chang ist ein Postdoktorand. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise, ob ein bestimmtes Gen eine Rolle bei der Krebsentstehung und -progression spielt, und welche Aspekte dieser Prozesse möglicherweise davon betroffen sind. Zunächst entwerfen und bestellen Sie die Oligonukleotide gemäß der beschriebenen Kriterien: Anil, die beiden komplementären Oligos, die die 20 bis 23 Nukleotide lange Zielsequenz im Zielgen enthalten.

Sie bilden EcoRI- und HindIII-Stellen an den beiden Enden. Nachdem sie denaturiert wurden, enthält ein weiteres Oligonukleotid eine komplementäre Sequenz zur Zielsequenz an seinem 3'-Ende, die an das 3'-Ende des H1- oder U6-Promotors mit einem upstream gelegenen Primer annealt.

Verwenden Sie eine PCR, um ein Fragment herzustellen, das an beiden Enden BamH1- und HindIII-Stellen aufweist. In der Zwischenzeit verdauen Sie den Lentivirus-Vektor und das PCR-Fragment. Führen Sie anschließend eine Ligationsreaktion mit drei Fragmenten zwischen dem Vektor, dem PCR-Fragment und den Anil-Oligonukleotiden durch.

Im molaren Verhältnis von eins zu 10 zu 10 erzeugt der resultierende Vektor die gewünschte HRNA mit einer Hindi-drei-Sequenz im Loop-Bereich. Falls ein induzierbarer Vektor verwendet wird, hängt die Produktion der HRNA von der Anwesenheit eines Induktormoleküls wie Doxycyclin für das Tet-on-System ab. Transformieren Sie nun hocheffiziente, kompetente E. coli-DH5α-Zellen mit dem ligierten Produkt und identifizieren Sie positive Vektoren mittels einer koloniebasierten PCR-Analyse.

Amplifizieren Sie ein Produkt, das die Vektor- und die induzierbare Promotor-Ligationsstelle überbrückt. Bereiten Sie Plasmid-DNA aus den positiven Kolonien mit einem kommerziellen Kit auf. Bestätigen Sie anschließend das Vorhandensein des Inserts durch BAM H one- und ECO R one-Verdauung sowie durch DNA-Agarose-Elektrophorese.

Sequenzieren Sie außerdem den Bereich, der den Promotor und S-H-R-N-A enthält, unter Verwendung von LIGA-Nukleotid P fünf. Bereiten Sie mithilfe eines endotoxinfreien MIDI- oder Maxi-Präp-Kit die Lentivirus-DNA vor, die die HRNA-Expressionskassette trägt. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration durch Messung der Lichtabsorption bei 260 Nanometern und überprüfen Sie die DNA-Reinheit, indem Sie sicherstellen, dass das Verhältnis der Lichtabsorption bei 260 zu 280 Nanometern zwischen 1,8 und 2,0 liegt.

Als letztes führen Sie das Lentivirus-Plasmid auf einem Agarosegel durch, um sicherzustellen, dass es supercoiled ist. Bereiten Sie vor der Transfektion zunächst die Transfektion vor, indem Sie langsam 0,9 Milliliter Lösung A in 0,9 Milliliter Lösung B tropfen, während Sie mit einer Pipette Luft durch Lösung B blasen. Anschließend inkubieren Sie das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach geben Sie langsam 0,6 Milliliter des Gemischs auf drei verschiedene 10-Zentimeter-Platten mit HEK 293T-Zellen.

Bringen Sie die Zellen anschließend vier bis sechs Stunden später wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie das Medium durch sieben Milliliter komplettes DMEM-Medium. Nach 24 Stunden geben Sie fünf weitere Milliliter Medium hinzu und nach weiteren 24 Stunden gewinnen Sie das Medium, das das Lentivirus enthält.

Zentrifugieren Sie das geerntete Medium bei 1500 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Filtern Sie das Überstand mit einem 0,45-Mikrometer-Filter. Zentrifugieren Sie das Durchfluss-Medium, das das Lentivirus enthält, mittels Ultrazentrifugation.

Den Überstand in einen Abfallbehälter mit 5 % Bleichmittel abgießen. Den Lentivirus-Pellet in einem halben bis einem Milliliter kaltem 1× PBS resuspendieren. Anschließend die Lentivirus-Lösung in Aliquots von 50 bis 100 Mikroliter aufteilen und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Bestimmen Sie abschließend den Titer des Lentivirus mithilfe einer zuverlässigen Methode. Typischerweise produziert eine 10 cm-Kulturschale 50 bis 100 Millionen infektiöse Einheiten, bevor mit der Zellinfektion fortgefahren wird. Ermitteln Sie das MOI des Lentivirus-Titers mit einem Kit oder mittels R-T-P-C-R für dieses Verfahren.

Ein MOI unter vier wird empfohlen. Beginnen Sie damit, die zu infizierenden Zellen in einer Sechs-Loch-Platte mit 30 bis 40 % Konfluenz auszusäen und kultivieren Sie sie über Nacht. Am nächsten Tag.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Milliliter frisches Medium, das Poly-Brain oder Protamin enthält. Geben Sie anschließend zwischen einer und zwei Millionen IE eines Lentivirus, das einen fluoreszierenden oder einen antibiotischen Marker enthält, hinzu.

Schütteln Sie die Platte langsam für 10 Sekunden, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie für sechs Stunden. Nach sechs Stunden ersetzen Sie das Medium durch normales, vollständiges Medium und kultivieren Sie die Zellen für zwei Tage. Das Medium sollte unabhängig vom verwendeten Lentivirus nach zwei Tagen keine Antibiotika oder Induktoren enthalten.

Fügen Sie das geeignete Antibiotikum hinzu, falls der Lentivirus einen antibiotischen Marker enthält. Ebenso fügen Sie einen Induktor in die Hälfte der Kulturen hinzu, falls der Lentivirus induzierbar ist. Nachdem die Zellen zwei oder drei Tage mit Antibiotika und Induktoren kultiviert wurden, führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um die Herunterregulation des Zielgens vor den Xenotransplantat-Trypsin-Augen zu überprüfen.

Die Zellen aus großen Zellkulturschalen werden in das ursprüngliche Medium resuspendiert, das 50 % Matrigel enthält. Es ist entscheidend, die Krebszellen resuspendiert zu halten und das Medium mit 50 % Matrigel sowie die Spritze auf Eis zu lagern. Andernfalls besteht die Gefahr, dass das Matrigel gerinnt, und die Injektion muss abgebrochen werden.

Bereiten Sie die chirurgische Operationsstelle vor, indem Sie sie gründlich mit 70 % Ethanol reinigen, und führen Sie die Anästhesie unter exzellenter Belüftung und mit einem Isofluran-Abzugfilter durch, der an die Induktionskammer angeschlossen ist. Betäuben Sie einen thymuslosen Nacktmäusen mit 2 % Isofluran, gemischt mit 1,5 % Sauerstoff, drei bis fünf Minuten vor der Zellinokulation. Anschließend wird die Anästhesie mittels 2 % Isofluran, gemischt mit Sauerstoff, über eine Nasenkonneke aufrechterhalten.

Platzieren Sie die Maus auf einer Heizplatte, die auf 30 Grad Celsius eingestellt ist. Geben Sie die Zellen in Spritzen mit Nadeln der Stärke 25½ für subkutane Injektionen bzw. mit Nadeln der Stärke 28 bis 30 für orthotopische Injektionen. Fünf Minuten nach Einleitung der Anästhesie an einer oder zwei Stellen injizieren Sie ein bis zehn Millionen Zellen in Bolusgaben von 200 Mikroliter.

Die Zellanzahl hängt von der Malignität oder Aggressivität der Krebszellen ab. Verwenden Sie für konstitutiv aktive Vektoren zwei Gruppen von Mäusen, die mit Zellen injiziert werden, die entweder das Zielgen S-H-R-N-A oder eine scrambelte S-H-R-N-A-Sequenz auf Vektoren exprimieren. Verwenden Sie dieselben beiden Gruppen und unterteilen Sie diese jeweils in Untergruppen, die entweder Induktor im Trinkwasser erhalten oder nicht.

Ersetzen Sie die mit Wasser gefüllten Beutel zweimal wöchentlich. Überwachen Sie das Tumorvolumen wöchentlich oder alle zwei Wochen mit einem C. Stellen Sie sicher, dass das Tumorvolumen die institutionellen oder A-CUC-Grenzwerte nicht überschreitet, und euthanasieren Sie alle Tiere, die umfangreiche Ulzerationen, Nekrosen, offensichtliche Infektionen, unkontrollierte Blutungen oder eine Endstadiumserkrankung aufweisen. Um das Tumorwachstum und die Metastasierung mittels eines biolumineszenten Markers zu überwachen, desinfizieren Sie den Arbeitsbereich und betäuben Sie die Mäuse in einer Bildgebungskammer mit gasförmigem Anästhetikum.

Stellen Sie zunächst eine Belichtung von zwei bis fünf Minuten ein, überprüfen Sie die Signalintensität und passen Sie diese entsprechend an. Wenn die Tumorgröße 1000 Kubikmillimeter oder die institutionelle Größengrenze überschreitet, euthanasieren Sie das Tier nach der Tötung, dokumentieren Sie die Tumorgröße und bewahren Sie die Tumore zur weiteren Analyse auf. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Auswirkungen einer Knockdowns von why Y1 auf die Xenotransplantat-Tumorbildung von Luciferase-exprimierenden humanen Brust-Adenokarzinomzellen zu untersuchen, die in athymischen Nacktmäusen implantiert wurden.

Die S-H-R-N-A-Zielsequenz des menschlichen YY1 und eine scrambelte Kontroll-S-H-R-N-A, die keine signifikante Ähnlichkeit zu irgendeinem bekannten menschlichen Transkript aufwies, wurden beide getestet. Als Ergebnis wurden zwei lentivirale Vektoren konstruiert und zur Herstellung zweier Lentiviren verwendet. Beide wurden genutzt, um zwei verschiedene Zellpopulationen zu infizieren, und es wurden polyklonale Zellpopulationen erhalten.

Nach der Puromycin-Selektion bestätigte die Western-Blot-Analyse die durch DS induzierte Verringerung von YY1 in diesen infizierten Zelllinien. Anschließend wurde die polyklonale Zellpopulation des Klon 3, die mit der induzierbaren YY1-s-h-r-n-A und der Kontroll-s-h-r-n-A infiziert worden war.

LENTIVIREN wurden verwendet, um die Auswirkungen der YY-eins-Depletion auf die Invasion zu testen. Wir beobachteten, dass die YY-eins-Depletion die Invasivität der Zellen verringerte. Die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass die induzierte YY-eins-Silenzierung in Zellen mit der induktiven YY-eins-S-H-R-N-A auftrat, während Zellen mit Kontrollkonstrukt keine Veränderung zeigten.

S-H-R-N-A zeigte diesen Effekt nicht. Diese Zellen wurden anschließend in einer Xenotransplantations-Mausmodell-Studie im Vergleich zu den Kontrollgruppen indu, YY1 S-H-R-N-A implantierten Mäusen untersucht, denen das enthaltende Wasser verabreicht wurde. Es zeigte sich eine signifikant verminderte Tumorbildung, sichtbar gemacht durch Biolumineszenz, und in Übereinstimmung damit bei der Messung des Tumorgewichts. Die Stilllegung von YY1 in diesen Xenotransplantattumoren wurde durch Western Blot leicht bestätigt.

Studien Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren gemäß den Sicherheitsüberlegungen des NIHB für die Forschung mit Lentiviralvektoren äußerst gefährlich sein kann. Für alle Laborumgebungen sind Sicherheitsstufe-2-Kontainmentverfahren mit erhöhtem Schutzniveau erforderlich.