و في المختبر اختبار حساسية الجلد (SIT) باستخدام البشرة البشرة الإنسان (ري) الموديل

يعتبر Epiderm نموذجاً مُعاد بناؤه في المختبر للبشرة البشرية، وهو مشتق من خلايا بشرية طبيعية، وطورته شركة Matt Tech Corporation. يحل بروتوكول اختبار تهيج الجلد باستخدام EC VM validated epiderm محل الاختبارات التقليدية القائمة على الحيوانات للمنتجات مثل مستحضرات التجميل، والمواد الخام، والعوامل الصناعية التي ستلامس جلد الإنسان. يبدأ هذا الاختبار في اليوم صفر عند وصول مجموعة أدوات تهيج الجلد وأنسجة epiderm إلى المختبر، ومن ثم يتم تهيئتها مسبقاً في وسط فحص بعد تحضينها طوال الليل.

في اليوم الأول، يتم تعريض السطح غير النمطي لنسيج البشرة لمركب مهيج مفترض لمدة ساعة واحدة، ثم يتم إزالة المادة المهيجة من خلال خطوة غسيل في اليوم الثاني. وبعد حضانة لمدة 24 ساعة، يتم وضع قطعة زرع الخلايا (culture insert) في وسط غذائي جديد، ويمكن استخدام الوسط القديم لتحليل السيتوكينات والكيموكينات المفرزة. بعد ذلك، يتم تفاعل النسيج مع مركب يُعرف باسم MTT، والذي يتم تحويله بواسطة إنزيم ريدوكتاز الميتوكوندريا إلى لون أرجواني داكن لغرض القياس المجهري والملحي.

توفير قراءة لمدى حيوية الخلايا. ويعد غياب اللون الأرجواني الداكن في العينة مؤشراً على انخفاض الحيوية. وعندما تكون القراءة اللونية للمركب المختبر أقل من 50% من الضوابط السلبية، يمكن تصنيف المركب المختبر على أنه مادة مهيجة.

مرحباً، أنا هيلينا كافا من مؤسسة مات. سنعرض لكم اليوم إجراء اختبار تهيج الجلد في المختبر باستخدام نموذج الجلد البشري المعاد بناؤه epiderm. يمكن استخدام هذا الإجراء، اعتماداً على المتطلبات التنظيمية، كبديل كلي أو جزئي لاختبار تهيج الجلد السريع في الجسم الحي.

يمكن استخدام هذا الإجراء الجديد في المختبر لتحديد المخاطر وتصنيف المواد الكيميائية والمواد الخام المستخدمة في مستحضرات التجميل. لذا، لنبدأ العمل. يُشتق Epiderm من مستنبت الخلايا الكيراتينية البشرية لتشكيل نموذج ثلاثي الأبعاد، متعدد الطبقات وعالي التمايز لبشرة الإنسان.

تتميز هذه الأنسجة بنشاط انقسامي وأيضي، وتحاكي نظيراتها في الجسم الحي بدقة من الناحيتين التركيبية والكيميائية الحيوية، وذلك مع ضمان قابلية التكرار كما هو الحال في البشرة البشرية. يتكون Epiderm من طبقات قاعدية وشائكة وحبيبية منظمة، بالإضافة إلى طبقة قرنية متعددة الطبقات. وتحتوي هذه الأخيرة على طبقات دهنية بين خلوية مرتبة في أنماط مماثلة لتلك الموجودة في الجسم الحي.

تُزرع هذه الأنسجة في وسط خالٍ من المصل. وتنمو كل نسيجة في غرسة زراعة خلوية منفصلة. وتتوفر تكوينات أخرى بما في ذلك تنسيق الإنتاجية العالية المكون من 96 بئراً.

يستغرق إنتاج الأنسجة حوالي ثلاثة أسابيع لاكتماله، وعند نقطة محددة في هذه العملية، يتم رفع النسيج إلى الواجهة الهوائية السائلة ويتم إزالة جميع السوائل من السطح القمي (APIC) للنسيج. تتغذى الأنسجة فقط من خلال السطح القاعدي الجانبي، الذي يظل ملامساً لوسط استزراع خاص بشركة mat tech. تحتوي مجموعة Epiderm النموذجية على 24 نسيجاً، بقطر 9 mm لكل نسيج في غرسة استزراع أنسجة خاصة به، بالإضافة إلى وسط مقايسة كافٍ لإجراء اختبار تهيج الجلد هذا.

يتم تثبيت الغرسات الـ 24 بإحكام على هلام AGA rose infused medium، حيث توضع أنسجة واحدة في كل بئر من ألواح ذات 24 بئرًا قياسية، ويتم الشحن عبر ناقل ليلي في درجة حرارة من 3 إلى 4 °C قبل البدء في اختبار المواد الكيميائية. باستخدام نظام اختبار EPIDERM، يتم تحضير وتعقيم جميع الأدوات والمعدات المستخدمة في المقايسة وفقًا لما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يجب أن تأتي بعض المواد، مثل المسحات القطنية، في عبوات معقمة أو يتم تعقيمها بجهاز الأوتوكلاف.

يجب استخدام الإيثانول بنسبة 70% لتعقيم الأدوات مثل الملاقط، كما يجب استخدام الأشعة فوق البنفسجية أو أشعة غاما لتعقيم زجاجات الغسيل. هناك محلولان أساسيان يُستخدمان في المقايسة يجب تحضيرهما مسبقاً، وهما DPBS ومحلول SDS بنسبة 5%. سيتم استخدام حوالي لترين من DPBS المعقم بـ pH سبعة في الماء المقطر في هذه المقايسة، حيث تحتوي المجموعة الواحدة على 24 نسيجاً بشرِيّاً.

يُستخدم محلول DPBS المعقم كضابط سلبي ومحلول غسيل في آن واحد. يجب تحضير محلول SDS بتركيز 5% واستخدامه كضابط إيجابي. يبدأ اختبار تهيج الجلد فور استلام مجموعة EPIDERM EPI 200 SIT.

تأكد من فحص سلامة جميع مكونات الطقم، وتواصل مع شركة Mat Tech فوراً في حال وجود أي مشكلة؛ وإذا كانت جميع المكونات متوفرة، انتقل إلى الخطوة التالية. لبدء الاختبار، اترك وسط المقايسة المرفق مع الطقم حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. لا تقم بالتسخين المسبق داخل غطاء التدفق الصفائحي.

قم بتجهيز طبق ست فتحات معقم واحد لكل ثلاث أدخالات من أنسجة البشرة، وانقل 0.9 milliliters من وسط المقايسة إلى كل فتحة تحت ظروف معقمة. افتح الكيس البلاستيكي الذي يحتوي على طبق الـ 24 فتحة الذي يضم أنسجة البشرة تحت تدفق هواء معقم. قم بإزالة الشاش المعقم واستخدم ملاقط معقمة لإخراج كل إدخال يحتوي على نسيج البشرة بعناية.

قم بإزالة أي بقايا من الـ aros الملتصقة بالجوانب الخارجية للقطعة المدرجة عن طريق التربيت اللطيف باستخدام شاش معقم أو ورق ترشيح. ثم ضع الأنسجة في طبق 24 بئراً معقماً وفارغاً خلال الدقائق الخمس التالية. افحص القطع المدرجة بصرياً.

سجل أي عيوب في الأنسجة وأي زيادة في الرطوبة على السطح. لا تستخدم الأنسجة المعيبة أو الأنسجة المغطاة بالكامل بالسائل.

أدراج الأنسجة المثالية. يجب أن يكون السطح جافاً وخالياً من أي انفصالات، أو أجزاء غير مستوية، أو سوائل زائدة على السطح. بعد ذلك، وباستخدام مسحة قطنية معقمة، جفف سطح الأنسجة بعناية.

حاول تجنب لمس الأنسجة مباشرةً. وتكفي التأثيرات الشعرية لإزالة الرطوبة من السطح بعد تجفيفه. انقل ثلاثة أنسجة إلى الصف العلوي من كل مجموعة مكونة من ستة.

لوح آبار مملوء مسبقاً بـ 0.9 milliliter من وسط المقايسة. قم بالتخلص من أي فقاعات هواء محتجزة أسفل الغرسات. بعد ذلك، ضع ألواح الآبار الستة التي تحتوي على الغرسات في الحاضنة لمدة ساعة واحدة.

تحضين مسبق عند 37 درجة Celsius. في نهاية فترة التحضين المسبق الأولى، انقل الحواضن (inserts) من الآبار العلوية إلى الآبار السفلية في الطبق ذي الستة آبار. أعد وضع الأطباق في الحاضنة للتحضين المسبق طوال الليل.

ضع المتبقي من وسط المقايسة في الثلاجة. بعد فترة ما قبل الحضن لليلة واحدة، يمكن تطبيق المواد الكيميائية المختبرة على مدرجات أنسجة البشرة. قبل البدء في مقايسة التعرض الكيميائي، ضع جميع الأجهزة والمحاليل والمواد الكيميائية المختبرة اللازمة في درجة حرارة الغرفة.

داخل غطاء التعقيم، امسح جميع زجاجات المواد غير المعقمة بـ 70%ethanol قبل وضعها داخل الغطاء. يجب وضع التحكم السلبي من DPBS المعقم والتحكم الإيجابي و 5%SDS والماء المقطر في الغطاء وفي درجة حرارة الغرفة أيضاً. يجب تخصيص قارورة كبيرة للنفايات.

قم بتجهيز طبق يحتوي على ستة آبار لكل مادة كيميائية، وذلك بملء الصف العلوي فقط بـ 0.9 milliliters من وسط المقايسة لكل بئر. ضع ملصقاً على كل طبق يتضمن رقم النسيج واسم المادة الكيميائية.

قبل خمس دقائق تقريبًا من التعرض المخطط له للمواد الكيميائية، أخرج الأطباق ذات الستة آبار التي تحتوي على الأنسجة المجهزة مسبقاً من الحاضنة. ثم قم بتقييم سطح الأنسجة بصرياً.

قم بإزالة أي رطوبة باستخدام مسحات قطنية معقمة مع تجنب الضغط على سطح النسيج. وأخيرًا، قم بوضع الملصقات على أغطية طبق الستة آبار متضمنة أكواد أو أسماء المواد المختبرة. لا تختبر أكثر من ست مواد كيميائية، بما في ذلك الضوابط السلبية والإيجابية، بحيث تُجرى كل منها في ثلاث مكررات في دورة اختبار واحدة.

استخدم فاصلًا زمنيًا مدته دقيقة واحدة لتطبيق المادة الكيميائية والغسل عند التعامل مع مواد اختبار معروفة. اتبع التعليمات الواردة في صحيفة بيانات سلامة المواد أو MSDS للعينات المرمزة أو غير المعروفة. التزم بإرشادات السلامة الكيميائية واستخدم خزانة ذات تهوية.

ارتدِ القفازات واحمِ عينيك ووجهك، وقم بمعالجة الأنسجة بالمواد الكيميائية على فترات زمنية فاصلة مدتها دقيقة واحدة لتسهيل شطف المواد الكيميائية المختبرة بعد التعرض، واحتفظ بالأطباق التي تحتوي على الأنسجة المعالجة داخل غطاء التدفق الصفائحي حتى يتم معالجة آخر نسيج. سيتم استخدام ماصة ذات رأس بصلي طوال الإجراء للتعامل مع الأنسجة والمركبات المختبرة. ويمكن استخدام لهب موقد بنزن لتشكيل الطرف ذي الشكل البصلي لاختبار المواد الكيميائية السائلة.

قم بتوزيع 30 µL من المادة الاختبارية السائلة مباشرة فوق النسيج، وباشر فوراً بتشغيل الموقت ليعمل بنظام العد التصاعدي. ضع الشبكة النايلونية على سطح النسيج. وعندما يصل الموقت إلى دقيقة واحدة، أضف المركب السائل الثاني. استخدم ثلاثة أنسجة لكل مادة كيميائية اختبارية، مع مراعاة إضافة كل مركب على فواصل زمنية مدتها دقيقة واحدة.

لاختبار المواد شبه الصلبة، استخدم ماصة إزاحة إيجابية لتوزيع 30 microliters مباشرة فوق النسيج. وإذا لزم الأمر، قم بتوزيع المادة الكيميائية باستخدام ماصة باستور لتتناسب مع حجم النسيج. وقبل وقت قصير من تطبيق المادة الصلبة، قم بترطيب سطح النسيج باستخدام 25 microliters من DPBS المعقم لتحسين تلامس سطح النسيج مع المادة الكيميائية المختبرة، ثم املأ ملعقة تطبيق دقيقة بسعة 25 milligram من المادة المختبرة المطحونة ناعماً.

ضع المادة الكيميائية الصلبة للاختبار على سطح النسيج. وإذا لزم الأمر، استخدم مصاصة معقمة ذات رأس بصلي لإفراغ الملعقة تماماً. رجّ الإدراجات بلطف لتحسين توزيع المادة الصلبة على السطح.

يمكنك أيضاً استخدام الرأس البصلي لماصة السوائل لديك ليتناسب مع حجم النسيج. لا تضغط على سطح النسيج. وأخيراً، قم بإضافة DPBS كضابط سلبي و 5%SDS كضابط إيجابي إلى مدرجات الأنسجة أيضاً في ثلاث مكررات، وبعد جرعة النسيج الأخير، انقل جميع الأطباق لمدة 35 ± 1 دقيقة إلى الحاضنة المرطبة عند 37 درجة Celsius.

خلال فترة التحضين هذه، تأكد من وضع جميع المواد اللازمة لخطوات الغسيل داخل غطاء التدفق الصفحي. بعد انتهاء التحضين لمدة 35 دقيقة، أخرج جميع الأطباق من المحضنة. ضعها داخل غطاء التدفق الصفحي المعقم وانتظر لمدة 60 دقيقة حتى يكتمل التعرض الكيميائي لأنسجة الجرعة الأولى.

بعد ذلك، ابدأ بإجراء الغسيل. اشطف الأنسجة بـ DPBS معقم 15 مرة. ولإزالة أي مواد اختبار متبقية، املأ قطعة إدراج الأنسجة باستخدام تدفق مستمر من DPBS يوجه على بعد 1.5 سنتيمتر من سطح النسيج ثم أفرغه.

تأكد من أن تدفق محلول DPBS ليس ضعيفاً جداً لضمان إزالة المادة المختبرة. تذكر الحفاظ على فاصل زمني مدته دقيقة واحدة لغسل أربعة أنسجة باستخدام شبكة نايلون خمس مرات، ثم قم بإزالة الشبكة بعناية باستخدام ملقط مدبب وحاد. بعد ذلك، استمر في عمليات الغسل العشر المتبقية، وبعد المرة الخامسة عشرة، اشطف الإدراج وهو مغمور تماماً ثلاث مرات باستخدام زجاجة غسيل تحتوي على 150 milliliters من محلول DPBS مع الرج لإزالة ما تبقى من المادة المختبرة.

أخيرًا، اشطف النسيج. أدخل المحلول مرة واحدة من الداخل ومرة واحدة من الخارج باستخدام DPBS معقم. تخلص من أي كمية زائدة من DPBS من النسيج عن طريق هز الحامل بلطف وتجفيفه باستخدام ورق تجفيف معقم.

بعد ذلك، انقل إدراجات الأنسجة الملطخة إلى طبق سداسي الفجوات الجديد الذي تم ملؤه مسبقاً بوسط المقايسة. وتذكر مجدداً ضرورة تنفيذ كل هذه الخطوات في غضون فاصل زمني مدته دقيقة واحدة للحفاظ على وقت التعرض البالغ 60 دقيقة لكل عينة معرضة. وبعد شطف آخر نسيج، جفف سطح كل نسيج بعناية باستخدام مسحة معقمة ذات طرف قطني.

إذا كانت هناك آثار متبقية من المادة الكيميائية على السطح، فحاول إزالتها باستخدام مسحة قطنية معقمة. وأخيراً، قم بتحضين الأنسجة في الحاضنة لمدة 24 ساعة القادمة. سجل وقت بدء التحضين في ورقة توثيق الطرق.

سجل أيضاً جميع التطبيقات المختلفة في ورقة توثيق الطريقة. ملحق بإجراء التشغيل القياسي المقدم من شركة Mat Tech Corporation لنقل الأطباق داخل غطاء التدفق الصفحي. انقل القطعة المدرجة إلى الجزء السفلي من طبق سداسي الفجوات المملوء مسبقاً بـ 0.9 milliliter من الوسط الزرعي.

اجمع الوسط من الصف العلوي وانقله إلى طبق مسبق التسمية يحتوي على 24 بئراً، ثم يوضع عند درجة حرارة -20 °C. وتعد عملية تحليل السيتوكينات و/أو الكيموكينات التي تم إطلاقها في وسط الزرع خطوة اختيارية حتى وقت التحليل. استمر في الحضن لمدة تتراوح من 18 إلى ±3 ساعات إضافية لاختبار MTT، ثم قم بتسمية طبقين يحتويان على 24 بئراً بالأسماء أو الرموز الكيميائية.

تذكر أن MTT مادة سامة، لذا تأكد من ارتداء القفازات الواقية عند التعامل معها. قم بتحضير محلول MTT عن طريق إذابة مركز MTT وتخفيفه باستخدام مخفف MTT.

يجب الحماية من الضوء لأن MTT حساس للضوء، ويُستخدم خلال ساعتين إلى ثلاث ساعات. ونظراً لأن MTT يتحلل بمرور الوقت، يتم نقل 300 µL من وسط MTT إلى كل بئر من آبار طبق الـ 24 بئراً. والآن، أخرج أطباق الستة آبار من الحاضنة.

جفف الجزء السفلي من الإدراج باستخدام ورق ترشيح، ثم انقلها إلى طبق ذي 24 بئرًا مملوء مسبقًا بـ MTT. ضع الطبق ذو الـ 24 بئرًا في الحاضنة واتركه لمدة ثلاث ساعات. لا تنسَ تسجيل وقت بدء حضن MTT في نظام إدارة البيانات (MDS)، والتزم بدقة بمدة الحضانة البالغة ثلاث ساعات لتجنب الحصول على قراءات MTT متفاوتة. عند اكتمال حضن MTT، استخدم مضخة شفط مزودة بمصيدة للنفايات السامة لسحب وسط MTT برفق من جميع الآبار.

أعد ملء الآبار بمحلول DPBS ثم قم بشفطه. كرر عملية الشطف هذه مرتين إضافيتين، وتأكد من جفاف الأنسجة بعد عملية الشفط الأخيرة. بعد عمليات الغسل، انقل الحشوات إلى طبق جديد يحتوي على 24 بئرًا، ثم اغمر الحشوات عن طريق سحب وإضافة 2 milliliters من محلول الاستخلاص بلطف داخل كل حشوة باستخدام الماصة.

سيرتفع المستوى فوق الحواف العلوية للداخلة، مما يؤدي إلى تغطية الأنسجة بالكامل من كلا الجانبين. قم بإغلاق لوحة الـ 24 بئراً باستخدام جهاز ختم حراري أو شمع البارافورم لمنع تسرب المستخلص والتبخر. سجل وقت بدء الاستخلاص في ورقة توثيق الطرق، واستخلص لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف باستخدام هزاز الأطباق. بعد اكتمال فترة الاستخلاص، قم بثقب الداخلات باستخدام إبرة حقن أو رأس بصيلة تتجاوز طول الماصة، واترك المستخلص يتدفق إلى البئر الذي أُخذت منه الداخلة.

تخلص من القطع المدرجة المثقوبة، ثم اسحب المحلول الموجود في البئر باستخدام الماصة للأعلى والأسفل ثلاث مرات حتى يصبح متجانساً. يمكن أيضاً استخدام هزاز أطباق مضبوط على 120 RPMs لكل نسيج. انقل حصتين بحجم 200 µL من محلول blue forma إلى طبق معايرة دقيقة مسطح القاع ذو 96 بئراً.

قم بنقل العينات المكررة وفقاً لتصميم اللوحة الثابت الموضح في جدول البيانات المرفق ببروتوكول الفيديو هذا بالنسبة للعينات الفارغة. استخدم ISO propanol، ثم قم بقياس الكثافة الضوئية أو OD باستخدام مقياس الطيف الضوئي للوحات ذات 96 بئراً عند طول موجي 570 nanometers دون استخدام مرشح مرجعي. أدخل النتائج في جدول البيانات لإجراء الحسابات التلقائية للنتائج.

يجب مراعاة التصحيحات الناتجة عن تداخل المواد الكيميائية المختبرة كما هو موضح في البروتوكول المرفق، وتُصنف المادة الكيميائية المختبرة على أنها مهيجة إذا كانت نسبة حيوية الأنسجة مساوية لـ 50% أو أقل بعد التحليل الطيفي الضوئي، وكانت قيمة OD 570 لأنسجة NC أكبر من أو تساوي 1 وأقل من أو تساوي 2.5، وكانت متوسط الحيوية لأنسجة PC معبراً عنها كنسبة مئوية من أنسجة التحكم السالب أقل من 20%، وكان الانحراف المعياري SD المحسوب من نسب الحيوية الفردية للأنسجة لثلاث مكررات عولجت بشكل متماثل أقل من 18%. يمكن اعتبار المركبات التي تعطي قيم حيوية خلوية أقل من 50% مواد مهيجة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء اختبار تهيج الجلد المعتمد لمدة 60 دقيقة و42 ساعة باستخدام نموذج الجلد البشري المعاد بناؤه Epiderm. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الجزء الأكبر من الاختبار يتم تحت ظروف معقمة أو مطهرة. إذا كانت هناك حاجة لإجراء أي تعديل على الطريقة أو إذا كنتم بحاجة إلى شرح أفضل لأي من خطوات الإجراء، فلا تترددوا في الاتصال بنا للحصول على المساعدة والمشورة.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.