رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

الهدف العام من هذا الإجراء هو التفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الجسم الحي وتحديد مصائر أنسجتها الخاصة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء حبيبات أولا من الخلايا ذات العلامات الوراثية ذات الأهمية. الخطوة الثانية من الإجراء هي وضع الحبيبات جراحيا تحت كبسولة الكلى لفأر يعاني من نقص المناعة.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي السماح لحبيبات الخلية بالتمايز لمدة ثمانية إلى 12 أسابيع تحت كبسولة كلية الفأر. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في حصاد الورم المسخي الناتج ، وإصلاحه للفورمالين ، وتحليل مصير الخلايا الموسومة بواسطة الكيمياء المناعية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن الخلايا الموسومة تتطور إلى واحدة أو أكثر من الطبقات الجرثومية الثلاث من خلال الأنسجة والكيمياء المناعية للأورام المسخية الناتجة.

مرحبا ، أنا كاريسا ريتنر من مختبر الدكتور هارولد بيرنشتاين في معهد أبحاث القلب والأوعية الدموية بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. سنعرض لك اليوم إجراء لتطوير الأورام المسخية عن طريق نقش كبسولة الكلى. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية ، للتأكد من أن كل خط نعمل معه يمكن أن يتطور إلى كل طبقة من الطبقات الجرثومية الثلاث ويجذب مصير الخلايا الجذعية ذات العلامات الوراثية في الجسم الحي.

تتم جميع الإجراءات التي سنعرضها لك بموافقة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. أيضا ، يتم تنفيذ جميع الأعمال مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بموافقة لجنة الإشراف على أبحاث الخلايا الجذعية بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. لذلك دعونا نبدأ.

لتحضير مزارع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، يرجى الرجوع إلى الجزء النصي من هذا البروتوكول. للحصول على ملاحظات في غطاء تدفق الصفيحة ، عالج مثبط الصخور المعالج مزارع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بملليغرام واحد لكل مليلتر من الكولاجيناز أربعة تحتضن لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون يستنشق الكولاجيناز أربعة من ، حسنا. استبدله بملليلتر واحد من DPBS بدرجة حرارة الغرفة مكمل بنسبة 10٪ بنسلين ستربتومايسين.

استخدم رافع الخلايا المسطحة لكشط المستعمرات من اللوحة ونقل 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل من أنبوبي الطرد المركزي الصغيرين. اشطف البئر بملليلتر واحد من DPBS وانقل 0.5 مل من الشطف إلى كل نبضة أنبوبية. قم بتدوير الأنابيب لمدة 20 ثانية عند 8 ، 000 مرة من الجاذبية ، واستنشق الجاذبية وأعد تعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من DPBS الطازجة عند 100 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر.

الليكتين Fasi vulgaris في DPBS لكل أنبوب للمساعدة في ربط الخلايا معا للزرع. احتضان تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتدوير الخلايا عند 8 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقتين لتوحيد الحبيبات.

قم بتدوير الأنابيب 180 درجة داخل آبار الدوار. ثم تدور مرة أخرى في 8 ، 000 مرة. الجاذبية لمدة دقيقتين.

استنشق بعناية ناسين SUP ، واترك الكريات سليمة لإخراج الكريات من الأنبوب. ماصة برفق 200 ميكرولتر من وسط KSR بجوار حافة الحبيبات حتى ترتفع ببطء. بمجرد إزاحة الحبيبات ، اسحب الوسائط على الفور إلى خلية ملي 0.4 ميكرومتر.

أدخل في بئر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من KSR. متوسط. احتضان لمدة ساعتين إلى ليلة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع فأر مخدر يعاني من نقص المناعة على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.

استخدم مقص التشغيل وملقط القزحية لعمل شق 2.5 سم عبر الجلد الموازي للعمود الفقري. لكن خارج المركز. قم بعمل شق أصغر من خلال العضلة أسفل الأضلاع مباشرة وعلى بعد سنتيمتر واحد تقريبا من العمود الفقري.

يجب أن يكون الشق كبيرا بما يكفي لسحب الكلية من خلاله ، ولكنه صغير بما يكفي بحيث لا تنزلق الكلية مرة أخرى إلى تجويف البطن دون قوة. باستخدام ماصة المعكرونة التي تم سحبها على شكل خطاف حاد ، اسحب الكلية برفق من خلال شق العضلات. بلل الكلى بشكل دوري باستخدام DPBS معقم لمنع الكبسولة الهشة من الجفاف باستخدام ملقط ناعم.

اسحب الكبسولة برفق بعيدا عن الكلى. استخدم مقص البندقية الربيعي لعمل شق بطول ملليمترين في الكبسولة. في وسط الكلى ، أدخل ماصة المعكرونة التي تم سحبها إلى مسبار ناعم جدا بين الكبسولة في الكلى واهتز برفق لتكرار جيب صغير على الجانب الآخر من الكلية بحيث يكون هناك جيبان.

واحد على كل عمود من الكلى. باستخدام طرف ماصة كبير في عملية نقل يمكن التخلص منها. ترفع الماصة حبيبات واحدة من إدراج الخلية الملي.

خذ أقل قدر ممكن من الوسط لأن الوسط الزائد يمكن أن يتداخل مع نقل الحبيبات. استخدم الملقط لتثبيت حافة الجيب على الكلى. ضع الحبيبات برفق بجوار الفتحة واستخدم مسبار الماصة المسحوبة لدفعها إلى الجيب باتجاه عمود واحد من الكلى.

ضع حبيبات ثانية في الجيب باتجاه القطب المقابل. ضع الكبسولة بحذر مرة أخرى على الكريات. لا توجد خيوط جراحية ضرورية لإغلاق الكبسولة.

استخدم ماصة معقوفة لدفع الكلية برفق إلى تجويف البطن. يجب أن يكون شق العضلات صغيرا بما يكفي بحيث يمكن إغلاقه بخيط حريري واحد. أغلق الجلد بسلسلة من أربع إلى خمس غرز متقطعة واسمح للحيوان بالتعافي من الجراحة قبل إعادته إلى منشأة بعد ثمانية إلى 12 أسبوعا من الجراحة.

قم بإزالة الورم المسخي الكلوي وأي أكياس محيطة به من تجويف البطن ككتلة من الأنسجة. ضع كتلة الأنسجة المكسوة بالكامل في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مليلتر يحتوي على تركيبة مخزنة بنسبة 10٪. اسمح للورم المسخي بالثبات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

قم بإزالة الورم المسخي من الأنبوب وضعه على حصيرة. استخدم مشرطا لتشريح أي أكياس وأكبر قدر ممكن من الكلى دون الإضرار بالورم المسخي نفسه. يمكن قطع الأورام المسخية الأكبر حجما إلى نصفين لتسهيل التشريح والتضمين.

قم بمعالجة الورم المسخي باستخدام تقنية تثبيت البارافين القياسية وأقسام تثبيت البقع على الشرائح للتحليل والتصوير. راجع الملاحظات الموجودة في الجزء النصي من البروتوكول للحصول على التفاصيل. سنعرض لك هنا أقسام الأنسجة من الورم المسخي النموذجي.

تم تلطيخ هذا الورم المسخي بالهيمات و eoin لتحديد الأنسجة الجنينية ، التي تمثل جميع الطبقات الجرثومية الثلاث وتظهر بنية أنبوب عصبي ناشئ تمثل الأدمة المتجهة. يقدم هذا القسم مثالا آخر على الأدمة المتجهة ، في هذه الحالة ظهارة حرشفية بدائية. هنا ، يمثل الغضروف المحاط بكبسولة من اللحمة المتوسطة المكثفة الأنسجة المشتقة من الأديم المتوسط الجنيني.

أخيرا ، يوضح هذا القسم الذي يظهر بنية معوية غدية الأنسجة الجلدية النهائية داخل الورم المسخي لرسم خريطة لمصير الخلايا الجذعية ذات العلامات الوراثية ، وتم زرع الأورام المسخية بمزيج من النوع البري و CD 1 33 الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الإيجابية. لوحظت الخلايا المشتقة الإيجابية CD 1 33 المشار إليها بالسهام في الأنسجة الناشئة عن الهيدر الجنيني ، وتحديدا الظهارة العصبية والهياكل الشبيهة بالأنبوب العصبي الوليدة. أنا الدكتور هارولد بيرنشتاين.

لقد أوضحت لك Carissa للتو كيفية تكوين الأورام المسخية من مزارع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لتوفير اختبار نمو في الجسم الحي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر مع خلاياك ومراقبة تقنية التعقيم. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.