اكتشاف مسببات الأمراض للأسماك باستخدام تحليل التكرار المتغير العددي (VNTR)

ابدأ بلوحة PCR تحتوي على محلول تفريغ يعتمد على الفورمايد.

أضف إلى كل بئر مكبرات PCR المخففة المستخرجة من بكتيريا ممرضة للأسماك.

تحتوي هذه الأمبليكونات على تكرارات متتالية متغيرة مع علامات فلورية (VNTRs)، وهي تسلسلات قصيرة متكررة تستخدم كعلامات جينية لتحديد البكتيريا.

أغلق اللوحة وجهاز الطرد المركزي للقضاء على فقاعات الهواء.

سخن اللوحة في جهاز تدوير حراري لإزالة الطابع المزدوج من VNTRs.

يعزز الفوراميد فصل الخيوط ويثبط إعادة التلدين.

قم بتبريد الصفيحة بسرعة لتثبيت الحمض النووي أحادي السلسلة.

جهاز طرد مركزي لجمع حجم العينة.

قم بإزالة الختم، وثبت اللوح بإطار.

ضع الأنبوب الشعري وقم بإجراء الرحلان الكهربائي الشعري.

أثناء الرحلان الكهربائي، تنتقل شظايا VNTR عبر الشعيرات الدموية تحت حقل كهربائي وتنفصل حسب الحجم.

يقوم الليزر بتحفيز العلامات الفلورية على كل جزء، مما ينتج إشارات مشفرة بالألوان.

يظهر تخطيط الكهروفيروجرام الناتج أنماط ذروة VNTR تتوافق مع البكتيريا الممرضة.

بعد تأكيد وجود مضخمات PCR، استخدم شرائط أو ألواح PCR جديدة لتخفيف منتجات PCR من 1 إلى 10 في مياه منقىة. دوامة وطرد مركزي لفترة وجيزة. أثناء العمل في خزانة أبخرة، حضر خلطة رئيسية في أنبوب طرد مركزي يتكون من الفوراميد ومحلول قياسي بحجم مرجعي.

وفقا لعدد منتجات PCR التي سيتم تحليلها، استخدم كميات المواد الكيميائية كما هو مفصل في المخطوطة. اترك حجم فائض بنسبة 10٪. يقوم دوامة لفترة وجيزة بتوزيع 9.5 ميكرولتر على آبار فردية على لوحة PCR مناسبة لنظام الرحلان الكهربائي الشعري المتوفر.

ثم أضف 0.5 ميكرولتر من منتج PCR المخفف. قم بالختم والطرد المركزي لفترة وجيزة. ثم قم بتحميل اللوحة التي تحتوي على العينات في جهاز دورة حرارة PCR وقم بإعادة تشكيل العينات عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل أن تبرد إلى 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.

قم بالطرد المركزي بوزن 1000 جرام لمدة دقيقة واحدة، ثم أزل الختم بعناية، وحمل اللوحة على نظام الرحلان الكهربائي الشعري المعاير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحليل الشظايا الكهربائي الشعري باستخدام الكواشف المناسبة للجهاز المختار، وضبط ظروف التشغيل وفقا للوصف الموجود في المخطوطة.