الحمض النووي القائم على تحديد الأنواع السمكية البروتوكول

نظام تحديد أنواع الأسماك هو طريقة بسيطة وسريعة ودقيقة تعتمد على الحمض النووي لتحديد أنواع الأسماك الموجودة في عينة معينة. تتم معالجة عينات الأسماك بالبروتيناز K لإطلاق الأحماض النووية في المحلول. ثم يتم عزل الحمض النووي الجيني للأسماك وتضخيمه PCR باستخدام الاشعال التي ترتبط بالتسلسلات الموجودة في جميع جينومات الأسماك.

ثم يتم هضم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بثلاثة إنزيمات تقييد مختلفة ويتم حلها على المحلل الحيوي Agilent 2100. يمكن استخدام أطوال الشظايا الناتجة في تفاعلات الهضم لتحديد أنواع الأسماك باستخدام تعدد أشكال طول جزء التقييد ، أو برنامج مطابقة نمط RFLP. مرحبا ، أنا راشيل فورموزا من Agilent Technologies.

سنعرض لك اليوم إجراء لتحديد أنواع الأسماك القائمة على الحمض النووي. هذا الإجراء هو طريقة فحص تسمح لك بتحديد أنواع الأسماك الموجودة في عينات طازجة أو مجمدة أو مفرومة أو مطبوخة أو مجففة أو معالجة بطريقة أخرى. ويمكن تحقيق ذلك في أقل من يوم عمل واحد.

نستخدم هذا الإجراء لدراسة أصالة المأكولات البحرية ، وهو أمر مهم جدا لصناعة المأكولات البحرية حيث يمكن أن يكون للاستبدال ووضع العلامات الخاطئة عواقب اقتصادية وبيئية وسلامة الأغذية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب بشكل خاص تحديد أنواع الأسماك عن طريق التحديد البصري والطرق التقليدية الأخرى. بمجرد معالجة السمكة ، يوفر اختبار الحمض النووي نتيجة أكثر دقة وموثوقية.

لذلك دعونا نبدأ. ابدأ في تحضير عينات لاستخراج الحمض النووي عن طريق وضع 10 إلى 1000 ملليغرام من كل عينة من أنسجة الأسماك النيئة أو المطبوخة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر لكل سمكة. عينة بسعة 220 ميكرولتر من محلول علبة البروتيناز المحضر حديثا والماصة لأعلى ولأسفل.

احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد جهاز الطرد المركزي للحضانة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 14،000 Gs لتكسير أي أنسجة غير مهضومة. بعد ذلك ، انقل بعناية 150 ميكرولترا من كل مادة طافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، وتجنب أي مادة غير مهضومة في الأسفل والمواد الزيتية الموجودة في الأعلى. سيتم الآن استخدام المادة الطافية لاستخراج الحمض النووي الجيني.

ابدأ استخراج الحمض النووي الجيني بإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي إلى كل عينة. سيؤدي ذلك إلى رفع حجم العينة الإجمالي إلى 650 ميكرولتر. دوامة العينة حتى تتجانس.

بعد ذلك ، انقل كل عينة إلى كوب تدور ربط الحمض النووي الذي تم وضعه في أحد أنبوبي وعاء المليلتر المتوفرين في المجموعة. قم بتثبيت غطاء الأنبوب على الجزء العلوي من كوب الدوران. قم بتدوير العينات لمدة دقيقة واحدة عند 14 ، 000 Gs لتحميل الحمض النووي على مصفوفة كأس الدوران.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة أكواب الدوران ، وتخلص من المرشح ، ثم ضع الأكواب مرة أخرى في أنابيب الوعاء. أضف 500 ميكرولتر من مخزن مؤقت واحد × غسيل الملح العالي. قم بتغطية الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بعد الطرد المركزي.

تخلص من المرشح ومرة أخرى ، ضع أكواب الدوران مرة أخرى في أنابيب الوعاء. أضف الآن 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول. قم بتغطية الأنبوب وقم بتدويره عند 14 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة.

كرر غسل الإيثانول مرتين أخريين بعد الغسيل الثالث في 80٪ من الإيثانول مرة أخرى ، وتخلص من المرشحات. استبدل أكواب الدوران في أنابيب الوعاء وهذه المرة تدور لمدة دقيقتين لتجفيف مصفوفة الألياف. الآن انقل أكواب الدوران إلى أنابيب تجميع سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتطور إلى كل كوب دوران مباشرة على مصفوفة الألياف داخل الكوب. ثم قم بتثبيت أغطية أنبوب التجميع على أكواب الدوران واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد الحضانة ، قم بتدوير العينات بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، تخلص من كوب الدوران وقم بتغطية الأنابيب. إذا تم قياس تركيزات الحمض النووي ، فمن المتوقع أن تتراوح تركيزات تتراوح من خمسة نانوغرام لكل ميكرولتر إلى 500 نانوجرام لكل ميكرولتر. يمكن الآن تخزين الحمض النووي عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد للتخزين طويل الأجل ، ضع الحمض النووي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات والكواشف المتوفرة في مجموعة كاشف P-C-R-R-F-L-P. وفقا للبروتوكول المكتوب المصاحب ، يوصى بتشغيل كل عينة ، بما في ذلك عنصر التحكم الإيجابي المضاد لعدم وجود قالب في نسختين أثناء تشغيل PCR. قم بإعداد خلطات إنزيم التقييد الرئيسية للهضم مع DTE E وواحد HAE وثلاثة و NL ثلاثة من خلال الجمع بين المكونات التالية بالترتيب ، 1.5 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم 0.5 ميكرولتر من 10 × إنزيم عازل و 0.5 ميكرولتر من 10 × إنزيم.

تحضير ما يكفي لجميع العينات بالإضافة إلى حجم تفاعل واحد ، وخليط كاشف أربعة فائق ثلاثة. ثم قم بتوزيع 2.5 ميكرولتر على كل أنبوب تفاعل مسمى باسم العينة والإنزيم. بمجرد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة العينات من جهاز التدوير الحراري ووضعها على الجليد.

أضف 2.5 ميكرولتر من كل منتج من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى كل من أنابيب الهضم التقييدية الثلاثة لهذا التفاعل. DDE واحد HAE ثلاثة ، و NLA ثلاثة. الدوامة التالية.

جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة واحتضان الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. إذا كان الأمر أكثر ملاءمة ، فيمكن أيضا احتضان عمليات الهضم بين عشية وضحاها. بعد الهضم ، احتضن التفاعلات عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف ميكرولتر واحد من 60 ملليمولار EDTA إلى كل أنبوب لإنهاء التفاعل والدوامة. باستخدام مجموعة كاشف المحلل الحيوي Agilent ، قم بإعداد وتحميل ملخص التقييد في آبار شريحة الحمض النووي وفقا لدليل المجموعة. لكل عينة ، يجب تحميل جميع الملخصات الثلاثة على نفس الشريحة.

ثم قم بتدوير الرقاقة وتحميلها في الجهاز. بعد انتهاء التشغيل، انتقل إلى سياق الفحص وحدد علامة التبويب ملخص الشريحة. في حقل اسم العينة ، أدخل اسم عينة لجميع بئر الرقاقة البالغ عددها 12 بئرا لتحديد أنواع الأسماك لعينات الحمض النووي للاختبار.

قم بتشغيل برنامج فك ترميز RFLP بالنقر فوق ملف. ثم افتح ملف XAD. سيتم فتح مربع الحوار المفتوح.

حدد الآن ملف XAD لشريحة الحمض النووي المستخدمة. وانقر فوق فتح لرؤية قائمة بالعينات التي تم تحميلها على الشريحة. حدد الملخصات الثلاثة المقابلة لعينة الحمض النووي الأولى.

ضمن عمود الإنزيم ، حدد إنزيمات التقييد التي تم استخدامها في الحقل المسمى الحد الأدنى لارتفاع الذروة كنسبة مئوية من العلامة الأدنى. القيمة الافتراضية هي 10٪ إذا لزم الأمر. يمكن خفض هذه القيمة لتحديد القمم الصغيرة التي تم تفويتها أو رفعها لتجاهل القمم الناتجة عن ضوضاء غير محددة في مخطط الكهرباء.

بعد إجراء أي تعديلات على الحد الأدنى لقيمة ذروة الارتفاع، انقر فوق إعادة الدمج. الآن انقر فوق calc في الجزء السفلي من مربع الحوار. ستقوم بيانات طول القطعة التي تم الحصول عليها من تشغيل المحلل الحيوي بملء حقول البرنامج.

بعد ذلك في القائمة المنسدلة للنقاط في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة ، حدد النرد. إذا كانت عينة الأسماك تتكون من نوع أو خليط واحد من الأسماك ، إذا كانت العينة قد تتكون من خليط ، فإن الجدول الموجود أسفل الشاشة المسمى قائمة الدرجات المجمعة. أفضل الأنواع تتطابق بناء على نتائج تفاعلات الهضم الثلاثة.

يتم تمييز التطابقات المثالية بدرجة واحدة باللون الأخضر. يتم تمييز التطابقات القريبة باللون الأصفر في الجزء العلوي من الشاشة. تحدد قيمة القطع الأقل الحد الأدنى لحجم القطعة المستخدم في التحليل وتحدد قيمة تفاوت المطابقة مدى قرب طول الجزء من الجزء المتوقع ليتم اعتباره مطابقا.

القيمة المعروضة هي الإعدادات الافتراضية ويمكن تعديلها. كرر هذه الخطوات لتحليل عينات الحمض النووي المتبقية على الحافة. تم عزل عينات الحمض النووي من أربعة أنواع مختلفة من الأسماك وتضخيمها وهضمها باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو.

هنا هلام محلل حيوي يوضح عينات ملخص التقييد باستخدام Agilent Bioanalyzer و RFLP decoder. تستخدم أنماط ثني البرامج لتحديد الأسماك هنا. يتم تحديد العينة الأولى بشكل صحيح على أنها سمك السلمون المرقط ، والثانية على أنها تونة ، والثالثة على أنها تربة صخرية.

والعينة الأخيرة كسمك القد المحدد. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء تحديد أنواع الأسماك القائمة على الحمض النووي باستخدام طريقة P-C-R-R-F-L-P الخاصة ب Agilent. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم تجنب التلوث المتبادل للعينات لأن الطريقة حساسة للغاية.

هذا كل شيء. أنت الآن تعرف كيفية التعرف بسرعة وسهولة ودقة على أنواع الأسماك الموجودة في عيناتك. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.