موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 3:12 دقيقة • March 31st, 2026
ابدأ بطبقين يحتويان على ديدان C. elegans تعبر عن SKN-1 البروتين الفلوري الأخضر الموسوم بعلامة SKN-1، وهو عامل نسخ موجود في السيتوبلازم الأمعاء. تحتوي هذه الديدان أيضا على حبيبات ليبوفوسين معوية تظهر التألق الذاتي.
يتم زرع إحدى اللوحين ببكتيريا غير ممرضة كمجموعة ضابطة، والأخرى مع البكتيريا الممرضة كمجموعة اختبار.
في مجموعة الاختبار، يسبب بيروكسيد الهيدروجين الناتج عن الممرض الإجهاد التأكسدي، مما يحفز انتقال SKN-1 إلى أنوية الأمعاء.
في المجموعة الضابطة، يبقى معظم SKN-1 موزعا بشكل منتشر في السيتوبلازم.
اغسل كل طبق باستخدام مخزن وانقل الديدان إلى أنابيب.
جهاز طرد مركزي لفصل الديدان وإزالة المخزن الخلفي.
أضف وسط يحتوي على أزيد الصوديوم لتخديرها.
قم بتركيب الديدان على وسادات الأغاروز، وضع أغطية الديدان، وراقب تحت مجهر فلوري. استخدم التألق الذاتي لتصور حدود النواة.
تشير إشارة SKN-1 النووية القوية في الاختبار، مقارنة بالإشارة السيتوبلازمية المنتشرة في الضابطات، إلى إعادة تموضع نووي وتؤكد الإجهاد التأكسدي الناتج عن الممرض.
باستخدام ماصحة، أضف حوالي 100 يرقة L4 إلى كل صفائح بذور من المكورات العقدية وNGM بذور الإشريكية القولونية . استخدم ثلاث أطباق لكل سلالة من البكتيريا.
حضن الألواح لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة الألواح من الحاضنة. اغسلها ب M9W واجمع الديدان في أنابيب مخروطية بحجم 15 ملليتر.
اغسل الديدان ثلاث مرات كما حدث سابقا في خطوة الطرد المركزي. أزل معظم M9W عن طريق الشفط. وأضف 500 ميكرولتر من M9W يحتوي على 2 مليمولر صوديوم أزيد أو هيدروكلوريد تتراميزول إلى حبيبة الدودة للتخدير.
حضن الأنبوب بحبيبات الديدان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم أسقط 15 ميكرولتر من تعليق الدودة على وسادة أجاروز محضرة. تحت المجهر الفلوري، يمكنك تصور تحديد موقع SKN-1 باستخدام مرشحات FITC وDAPI.
صور دودة بتكبير 10 أضعاف و20 مرة. تقييم الديدان بناء على ثلاثة مستويات من التوطين؛ تحديد موضع منخفض، حيث لا يلاحظ توطين نووي، توطين متوسط، مع وجود SKN-1 BCGFP في الجهة الأمامية أو الخلفية للدودة، وتحديد موضع مرتفع، حيث يلاحظ التمركز النووي ل SKN-1 BCGFP في جميع خلايا الأمعاء.