الركض الخلايا الجذعية العصبية البشرية

مرحبا ، أنا ستيف. أعمل في مختبر الدكتور فلاناغان في قسم علم الأمراض في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين. سأوضح لكم اليوم كيفية تقسيم الخلايا السلائف العصبية البشرية.

تتضمن هذه التقنية ترميز قارورة جديدة بمحلول فيبرونكتين بشري ، ورفع الخلايا باستخدام المخزن المؤقت لتفكك الخلايا ، ثم تحييد المخزن المؤقت لتفكك الخلايا بمحلول مصل بنسبة 10٪ ، وتحريك تعليق الخلية وتعليق الخلايا في حالة جديدة ومتوسطة ونقل تعليق الخلية إلى قارورة جديدة. في مختبرنا ، نقوم بزراعة الخلايا السليفة العصبية البشرية عن طريق تغيير نصف وسائطها كل يومين ، ونمررها مرة واحدة في الأسبوع عن طريق تقسيم واحد إلى اثنين. عندما أقوم بتمرير الخلايا ، قد أعدها إذا كنت أرغب في استبدالها بتجربة كيمياء مناعية ، أو إذا كنت أرغب في إجراء تعداء باستخدام مستجيب نووي.

من المهم استخدام المخزن المؤقت لتفكك الخلايا عند تعبئة الخلايا لأنه أولا ، غير إنزيمي ، على عكس التربسين ، وهو ألطف بكثير على الخلايا. مرحبا ، نحن في غرفة زراعة الأنسجة الآن ، وقبل أن أريكم كيف تبدو قارورة ملتصقة من خلايا السلائف البشرية ، سأقوم أولا بإعداد مزرعة الأنسجة. أولا ، سأطفئ ضوء الأشعة فوق البنفسجية وأشغل الضوء وتدفق الهواء.

بعد ذلك ، سأقوم بتطهير الغطاء بنسبة 70٪ من الإيثانول عن طريق رش منشفة ورقية ومسح الغطاء. من المهم رش منشفة ورقية بنسبة 70٪ من الإيثانول وليس داخل غطاء المحرك مباشرة لأن رش الغطاء بنسبة 70٪ من الإيثانول قد يؤدي إلى إتلاف مرشح HEPA ، وهو مكلف حقا. بعد ذلك ، سأقوم برش جميع الكواشف والأدوات.

وأخيرا ، سأقوم برش خراطيم التفريغ ، ونحن جميعا جاهزون. دعونا نلقي نظرة على هذه الخلايا. لذا فإن هذه الخلايا تبدو حوالي 80٪ ملتقية.

هذه هي الخلايا السلائف العصبية البشرية المعزولة عن الأجنة البشرية ، ونحن نزرعها في قوارير T 25. نقسمهم كل أسبوع ، من واحد إلى أسبوعين. أنا مستعد لتمرير زنازاني الآن.

وأولا سأحضر قارورة T 25 جديدة قمت بتغطيتها لمدة أربع ساعات بفيبرونيكتين بشري من BD Biosciences. لذلك أزلت محلول الفيبرونيكتين. سأقوم بشطف هذه القارورة باستخدام BBS قبل أن أنقل الخلايا إلى القارورة.

والآن سأخرج الخلايا من حاضنة 37 درجة. ها هم أولاء. الآن سأقوم بإزالة محلول غسيل PBS من القارورة الجديدة المغطاة بفيبرونكتين بشري.

وسأضيف ملليلترين من الوسائط القديمة المكيفة إلى القارورة الجديدة. لذا أحتاج الآن إلى شطف خلاياي باستخدام PBS قبل أن أتمكن من إزالته من السطح. لذا أولا ، سأقوم بإزالة الوسائط المتبقية ، وإضافة حوالي ملين من PBS على الفور دون ترطيب الخلايا.

سأنتظر حوالي دقيقتين قبل إزالة PBS وطرح المخزن المؤقت للتفكك للبيع من أجل إزالة المبيعات عن سطح الرقائق. الآن سأقوم بإزالة PBS ، ومرة أخرى ، سأحاول إضافة مخزن مؤقت لتفكك الخلايا على الفور حتى لا تجف الخلايا. لذلك سأضيف 1.5 مل من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا.

وعلى عكس PBS ، سأقوم بإضافته مباشرة إلى الخلايا وسأحاول تغطية أكبر قدر ممكن من السطح. لذلك أقوم بتحريك القارورة من جانب إلى آخر بينما أقوم بإضافة هذا المخزن المؤقت ببطء إلى الخلايا. وسأنتظر الآن حوالي خمس دقائق حتى تبدأ الخلايا في الخروج من السطح.

وسأترك القارورة في درجة حرارة الغرفة في الغطاء. كما ترون هنا ، تبدأ الخلايا أولا في التقريب ثم تبدأ في الخروج من السطح ويمكنك في الواقع رؤية بعضها ، بعض الخلايا تطفو بالفعل. وإذا قمت بالنقر على القارورة على نطاق واسع على الجانب ، فسيساعدهم ذلك على الخروج.

لقد مرت خمس دقائق ، وكما ترون ، أصبح المحلول كثيفا حقا بالخلايا التي خرجت من السطح. والآن سأقوم بتحييد تأثير المخزن المؤقت لتفكك الخلايا عن طريق إضافة 4.5 مل من المصل المحتوي على وسط. لذلك سأستخدم مصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ في وسائط D-M-E-M-F 12 ، وسأضيفه مباشرة على سطح القارورة للتأكد من عدم وجود خلايا متبقية متصلة.

وسأقوم بذلك ، وسأقوم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل لإخراج أي خلايا متبقية. ثم سأقوم بنقل محلول الخلية إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل. وسأقوم بتدويرها بسرعة ألف دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.

لذا يتم الانتهاء من دوران الخلايا ولدينا هنا منصة خلوية جميلة. سأقوم بإزالة وسائط المصل بعناية فائقة دون محاولة إزعاج البليت. وبعد ذلك سأقوم بتعليق البليت بأربعة ملايين من وسائل الإعلام.

لذلك سأحاول إعادة تعليق الحبيبات بحيث لا توجد كتل خلوية متبقية بحيث يصبح المحلول متجانسا ويحتوي على كتل. وبما أنني أقوم بتقسيم واحد إلى اثنين ، سآخذ اثنين من المطاحن الأربعة وأنقلها إلى القارورة الجديدة التي تحتوي بالفعل على ملين من وسائط الحالة. وأخيرا ، سأقوم بتسمية القارورة بنوع الخلية ورقم المقطع والتاريخ.

هذه نظرة على الخلايا التي مررنا بها قبل نصف ساعة. وكما ترون ، فقد تم ربط معظمهم بالسطح وبدأوا في إرسال العمليات. هذا كل شيء أيها الناس.

والآن أنا مستعد للعد.