بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو القضاء على التعبير الجيني المستهدف في DCS عن طريق تعداء الحمض النووي الريبي SI. يتم تحقيق ذلك عن طريق برمجة مستجيب AM Maxin Nucleo أولا. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في خلط DCS و siRNA معا وماصة محلول الخلية الناتج في وحدات Nucleo QVE.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي وضع اللوحة في صينية مكوك amaxa لبدء عملية التعداد. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي إصابة الخلايا بالفيروس لتنشيط استجابة الإنترفيرون. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر ضربة قاضية للجينات من خلال R-T-P-C-R الكمي والنشاف الغربي.

هذه التقنية ذات قيمة لتوصيف مسارات الإشارات في الخلايا المتغصنة وقد تساهم في تطوير العلاجات المناعية القائمة على الخلايا المتغصنة. لبرمجة عامل نواة مكوك البئر Maxon 96 لتعداء التيار المستمر ، افتح ملف معلمة جديد. حدد عدد الآبار التي ستستخدمها للتعداء القياسي عن طريق سحب المؤشر فوق مخطط لوحة البئر 96.

استخدم ما لا يقل عن ثلاثة آبار لتجميع كل عينة تجريبية. أدخل الآن رمز البرنامج في الجزء الأول حدد F و F و i الجزء الثاني ، حدد 1 68 من القوائم المنسدلة. ثم من مربع الحل ، حدد الخلية الأحادية البشرية التالية ضمن خيار التحكم حدد قياسي ، ثم انقر فوق تطبيق.

لتضمين عنصر تحكم بدون تعداد، يلزم تحديد آبار إضافية من الرسم التخطيطي. ثم من خيار التحكم ، اختر عدم وجود عنصر تحكم في البرنامج وانقر فوق تطبيق مرة أخرى. بعد خلط محلول عاطفة النواة ، اتركه يسخن إلى درجة حرارة الغرفة.

ضع عدد وحدات النواة المطلوبة في لوحة VETE للنواة في الاتجاه الصحيح كما هو موضح هنا عن طريق إدخال الوحدة الأولى في الوردة الأولى والثانية ثم هكذا لجميع الأنابيب التالية. انقل ما يكفي من DCS من قارورة زراعة الخلية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ليحتوي على 500،000 خلية لكل بئر لجهاز الطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 400 جم عند أربع درجات مئوية ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. بعد ذلك ، أضف محلول المودة النووية إلى الأنبوب ثم أعد تعليق DCS عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات.

الآن قم بتسمية أنابيب DPH وفقا للمعالجة المحددة التي سيتم إجراؤها ، ثم قم بتقسيم الخلايا المعلقة إلى الأنابيب المسماة. أضف الحمض النووي الريبي SI بتركيز نهائي قدره 0.25 ميكروغرام لكل 500،000 خلية إلى أنابيب epi endorf المناسبة ، ثم امزج معلقات الخلية عن طريق سحب العينات. استخدم الحمض النووي الريبي SI غير المستهدف لعينة التحكم في عدم التعداد.

ثم قم بإدخال 20 ميكرولترا من تعليق خلية SI RA DC في وحدات النواة وفقا للتخطيط التجريبي المبرمج مسبقا ، مما يضمن توصيل السائل إلى قاع البئر ، وقم بتغطية لوحة النواة بغطاء ، واضغط على اللوحة على سطح صلب عدة مرات لتسهيل إزالة فقاعات الهواء لنقل التيار المستمر. أدخل لوحة النواة Yvette المحضرة في علبة مكوك النواة 96 جيدا. ثم انقر فوق زر التحميل والبدء.

تابع تقدم عملية التعداء على الشاشة. يشير الصليب الأسود على خلفية خضراء إلى تعداء ناجح في ذلك البئر ، في حين أن الشريط الأسود على خلفية حمراء يعني أنه لم ينجح أثناء نقل الخلايا. قم بتسخين وسط نمو التيار المستمر عند الانتهاء من عملية التعدي ، قم بإزالة اللوحة وإضافة 80 ميكرولترا من وسط نمو التيار المستمر الدافئ إلى كل بئر.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، يمكنك الآن احتضان اللوحة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون. خلال فترة الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط نمو التيار المستمر الدافئ إلى أنابيب المصفوفة في نفس اتجاه إعداد لوحة الكوفيت النووية. بعد فترة الحضانة ، انقل كل 100 ميكرولتر من معلقات الخلية من النواة CVEs إلى أنابيب المصفوفة المرتبة مسبقا.

ثم قم بإزالة والتخلص من تلك الأنابيب التي لم يحدث فيها التعدي. أخيرا ، احتضان أنابيب المصفوفة لمدة 24 ساعة أو أي فترة زمنية أخرى مرغوبة. قم بتسمية أنابيب einor لكل من أنابيب مصفوفة الحضانة.

ثم انقل أنابيب المصفوفة من الحاضنة إلى غطاء مزرعة الخلية وقم بتجميع أنابيب المصفوفة لكل عينة تجريبية في dfs للنهاية المسماة مسبقا. بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا برفق عن طريق تدوير أنابيب DPH في جهاز طرد مركزي سطح المكتب لمدة 10 دقائق. عند 400 جم ، قم بإزالة snat وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو خال من المصل يحتوي على فيروس مرض نيوكاسل أو NDV في وزارة الداخلية لواحد بشكل فضفاض.

قم بتغطية الإندورفين epi بطريقة معقمة ثم احتضان الأنابيب لمدة 45 دقيقة. بعد فترة الحضانة هذه ، أضف 900 ميكرولتر من وسط نمو التيار المستمر وأعد احتضان الأنابيب لمدة ثماني إلى 10 ساعات أخرى. لحصاد dcs المنقولة والمصابة.

قم بتحبيير الخلايا عن طريق تدوير أنابيب einor في جهاز طرد مركزي سطح المكتب كما كان من قبل وقم بإزالة الخلايا الأحادية snat التي تم نقلها إما باستخدام IRNA الذي يستهدف RIG I أو توهج غير محدد irna وأصيبت ب NDV كما هو موضح بعلامة زائد أو ظلت غير مصابة كما هو موضح بعلامة الطرح كما تم اكتشافها بواسطة ضربة قاضية R-T-P-C-R-A الكمية ل R RGA بنسبة 75٪ عند مستوى النسخ لوحظ انخفاض مماثل في التعبير عن إنترفيرون بيتا. كما لوحظ مستجيب مصب RGA في سلسلة إشارات الإنترفيرون. علاوة على ذلك ، لم يكن من الممكن اكتشاف التعبير عن إنترفيرون بيتا في الخلايا الضابطة غير المصابة.

في حين أن جين MXA وإنترفيرون بيتا كان الحد الأدنى. هنا. تظهر في هذه التجربة بيانات من تعداء ثان ل DCS مع استهداف صارم irna كما في الشكل السابق. ومع ذلك ، فإن جميع الخلايا مصابة ب NDV وتم دمج عنصر تحكم إضافي باستخدام Monocyte DCS غير المقطوعة.

كانت نتائج إسكات الجينات مشابهة لتلك التي لوحظت في الشكل السابق. كشفت وصمة عار غربية تم فحصها بحثا عن RGA أن التعبير البروتيني لهذا الجين قد تم حظره تماما. يظهر المساران الأول والثاني بيانات عن المحللات من الخلايا غير المقطوعة.

تظهر الممرات الثالثة والرابعة التحلل من توهج irna الخلايا والممرات الخامسة والسادسة تظهر المحللات من الخلايا المنقولة باستخدام RIG I التي تستهدف S Irna بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة ، بما في ذلك هدم العديد من الجينات في وقت واحد.