كروماتوغرافيا التقارب المستندة إلى DFE: تقنية لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2F5 من عينة خام باستخدام ظروف شطف قائمة على القوة الأيونية العالية

DFE أو DsRed-2F5-Epitope هو بروتين اندماج مؤتلف يتكون من DsRed ، وهو بروتين فلوري ، وحادمة 2F5 - جزء من مستضد البروتين السكري لغلاف فيروس نقص المناعة البشرية -1. هذه الحاتمة لها تقارب كبير مع نظيرتها - وهي منطقة في منطقة تحديد التكامل على الجسم المضاد أحادي النسيلة 2F5.

لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2F5 من عينة خام ، خذ عمودا معبأا بخرز راتينج مسامي يحتوي على روابط تقارب DFE ثابتة على سطحها. اشطف العمود بمخزن مؤقت مناسب للحفاظ على درجة الحموضة ومنع التفاعلات غير المحددة بين مكونات العينة والراتنج في الخطوات اللاحقة.

قم بتحميل العينة التي تحتوي على الأجسام المضادة أحادية النسيلة المستهدفة 2F5 في العمود. تدريجيا ، تبدأ الأجسام المضادة في العينة في التدفق عبر العمود أو المرحلة الثابتة.

أثناء التدفق ، تتفاعل الأجسام المضادة بشكل عكسي مع روابط تقارب DFE المثبتة في المرحلة الثابتة. في هذه التفاعلات ، يرتبط النظير الموجود على الجسم المضاد 2F5 على وجه التحديد بحتمة تكميلية على رابط DFE.

اغسل العمود بمخزن مؤقت للتوازن لإزالة العينة غير المرغوب فيها المرتبطة بشكل غير محدد بالعمود. قم بتمرير مخزن مؤقت للشطف عبر العمود.

القوة الأيونية العالية للمخزن المؤقت على زعزعة استقرار التفاعلات بين روابط DFE والأجسام المضادة أحادية النسيلة 2F5. وبالتالي ، فإن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة تخرج كأجزاء من العمود.

اجمع أجزاء الأجسام المضادة المنقاة ، وقم بتخزينها للتطبيقات النهائية.

أولا ، قم بإعداد 100 مل من المستخلص النباتي المصفى الذي يحتوي على 2F5 أو المادة الطافية من نظام التعبير الخلوي المفضل ، والذي يحتوي أيضا على 2F5. بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتوازن والمخزن المؤقت للشطف عالي القوة الأيونية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. اغسل نظام الكروماتوغرافيا بالمخازن المؤقتة.

قم بتركيب عمود تقارب DFE على نظام الكروماتوغرافيا ، وقم بالتوازن مع 5 CV من المخزن المؤقت للتوازن بمعدل تدفق 1 مليلتر في الدقيقة. راقب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتحميل 80 مل من مستخلص النبات المصفى أو المادة الطافية على العمود بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة لضمان وقت تلامس لمدة دقيقتين. اجمع عينات التدفق في كسور 2 ملليلتر لإعادة بناء منحنى الاختراق.

قم بتخزين عينات التدفق على حرارة 4 درجات مئوية ، إذا لم يكن التحليل الفوري للعينة ممكنا. بعد ذلك ، اغسل العمود ب 6 سير ذاتية من المخزن المؤقت للتوازن. اجمع عينة في بداية الغسيل ووسطه ونهايته. قم بإزالة mAb 2F5 ب 5 أحجام من المخزن المؤقت للشطف عالي القوة الأيونية. اجمع جزء DFE عندما تزداد إشارة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر إلى 5 وحدات امتصاص مللي فوق خط الأساس.