تقنية في المختبر لدراسة تفاعل الخلايا التائية مع الطبقات الدهنية المستوية المدعومة

خذ شريحة تدفق تحتوي على طبقة ثنائية دهنية مدعومة ، أو SLB.

يتم اقتران SLB مع روابط محددة - جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 أو ICAM-1 والأجسام المضادة المضادة ل CD3 - المسمى بالفلوروفورات.

أضف الخلايا التائية ومضاد CD107a Fab الذي يحمل علامة الفلوروفور - الجزء المرتبط بالمستضد لجسم مضاد ضد علامة التحلل.

يرتبط مركب مستقبلات الخلايا التائية CD3 أو TCR-CD3 بالجسم المضاد ل CD3 ، مما يؤدي إلى تشغيل TCR.

الإشارات من الداخل إلى الخارج التي يسببها الزحف على تنشيط الإنتجرينات على السطح ، والتي ترتبط ب ICAM-1 الثابت.

يؤدي الاقتران إلى إعادة تنظيم الهيكل الخلوي - إعادة ترتيب الأنابيب الدقيقة ، وبلمرة الأكتين التي تؤدي إلى الانتشار الجانبي للخلية على سطح SLB.

يسمح الانتشار لمزيد من تفاعلات مستقبلات الترابط لتشكيل مجموعة تنشيط فوق الجزيئات أو SMAC ، مما يؤدي إلى إنشاء مشبك مناعي.

تتحرك حبيبات الخلايا التائية اللايتية على طول الأنابيب الدقيقة وتندمج مع غشاء البلازما ، مما يكشف عن علامات التحلل على سطح الخلية ، والتي ترتبط بمضاد CD107a Fab.

باستخدام المجهر الفلوري ، تصور المشبك المناعي المخصب بمجمعات TCR-CD3 والإنتجرينات وعلامات التحلل.

ابدأ باستخدام ملقط من نوع مقص البولي بروبلين لغمر الأغطية الزجاجية في محلول سمكة المفترسة الحمضية المحضرة حديثا لمدة 25 إلى 30 دقيقة. في نهاية الغسيل، اشطف الغطاء سبع مرات بكمية منعشة من الماء فائق النقاء لكل غسلة، واترك الغطاء المبلل جانبا للسماح للماء المتبقي بالتدحرج من الزجاج النظيف.

عندما تجف الغطاءات ، قم بتجميع ميكرولترين من خليط الجسيمات الشحمية النهائي ، على وجه التحديد ، في وسط قناة منزلقة ذاتية اللصق داخل غطاء تدفق معقم ، وعلى الفور ولكن بعناية ، قم بمحاذاة غطاء نظيف وجاف مع الشريحة للسماح بإنزال الغطاء برفق على الجانب اللاصق من الشريحة ، واستخدم الحلقة الخارجية لملقط من نوع مقص البولي بروبلين لتطبيق ضغط لطيف على التلامس المحيطي للشريحة قم بتغطية الشريحة ، مع التأكد من أن الانزلاق متصل بإحكام بالشريحة لمنع التسرب. بعد ذلك ، اقلب الشريحة ، واستخدم علامة دائمة لرسم أربع نقاط حول الطبقة الثنائية على الجانب الخارجي لمجموعة الشريحة.

قبل الحقن الأول ، قم بتعيين منفذ واحد من القناة كمنفذ دخول والآخر كمنفذ خروج ، مع الحفاظ على هذا التعيين طوال التجربة. لتجنب تكون الفقاعة، أدخل طرف طرف الماصة مباشرة في منفذ الإدخال حتى تشعر بالختم المطاطي لقناة الانزلاق يتم اختراقه بالطرف.

ببطء ، املأ القناة ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص الدافئ. قم بحقن 200 ميكرولتر من كلوريد النيكل (II) في محلول حجب الكازين في منفذ الدخول ، وقم بإزالة 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت من منفذ الخروج. بعد حضانة لمدة 45 دقيقة ، قم بإزالة محلول الكازين الزائد من منفذ الخروج.

حقن 100 ميكرولتر من محلول ICAM-1 والستربتافيدين في منفذ الدخول لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول البروتين الزائد من منفذ الخروج ، واغسل الطبقة الثنائية مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من عازلة الفحص لكل غسلة. بعد ذلك ، قم بتسمية الطبقات الثنائية ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد ل CD3 المترافق بالفلوروفور لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسلتين في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص لكل غسلة ، كما هو موضح.

لتصوير تفاعلات الخلايا التائية ثنائية الطبقة، ضع الشريحة على المرحلة الساخنة بزاوية 37 درجة مئوية من مجهر الانعكاس الداخلي الكلي، أو TIRF، واضبط المرحلة باستخدام علامات الحبر لتوسيط الطبقة الثنائية على هدف 100 قوة.

لتصوير إطلاق الحبيبات ، أضف شظايا الجسم المضاد المضاد ل CD107a المترافق بالفلورة إلى تعليق الخلايا التائية CD4 ، وأعد تعليق الخلايا المسماة في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص للحقن في منفذ دخول قناة الشريحة. بعد ذلك ، حدد العدد المناسب من الحقول التجريبية ، وسجل الصور لكل حقل مرة كل دقيقة لمدة 30 دقيقة بعد الحقن.