تقييم استيعاب البروتينات السطحية المستهدفة باستخدام مشتق البيوتين

عالج الخلايا النجمية القشرية للفأر بمشتق البيوتين القابل للانقسام.

احتضان عند درجة حرارة منخفضة لمنع استيعاب البروتين وتسهيل ارتباط البيوتين بالبروتينات السطحية المستهدفة.

اغسل وأضاف وسط دافئ ، ثم احتضنه للحث على استيعاب البروتينات الحيوية.

اغسل وعالج بعامل اختزال غير منفذ للغشاء لشق البيوتين غير الداخلي.

أضف كاشف التبريد لإيقاف التفاعل وغسله.

حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية.

أضف مخزلا مؤقتا للتحلل للخلايا ، وإطلاق البروتينات الحيوية غير الحيوية والداخلية

جهاز طرد مركزي لتكسير حطام الخلية.

اجمع المادة الطافية المحتوية على البروتينات ، وأضف حبات الستربتافيدين - الاغاروز ، واخلطها لالتقاط البروتينات الحيوية.

جهاز طرد مركزي لحبيبات الخرز والتخلص من المادة الطافية.

أضف عازلة تحميل وحرارة لتغيير طبيعة البروتينات وإطلاقها من الخرز.

قم بتشغيل البروتين على مادة هلامية وانقله إلى غشاء نشاف.

الكشف عن استخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية لتصور نطاق بروتيني مميز ، مما يؤكد استيعاب البروتين الناجح.

أولا ، قم بإزالة مزارع الخلايا النجمية من الحاضنة وشفط الوسط. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 ملليلتر من CM-PBS المبرد وضع الأطباق على الثلج المجروش. قم بشفط CM-PBS ثم قم بإدخال 3 ملليلتر من البيوتين المؤقت في كل طبق. قم بإمالة الأطباق ذهابا وإيابا عدة مرات للتأكد من توزيع المخزن المؤقت جيدا ، واتركها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

ثم قم بشفط عازلة البيوتين واستبدله ب 5 ملليلتر من الوسط الدافئ. احتضن طبق استزراع واحد على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وطبقا ثانيا بنفس درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة. اترك طبقا آخر عند 4 درجات مئوية كعينة دقيقة صفر.

في نهاية فترة الحضانة ، تخلص من الوسيط واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 ملليلتر من CM-PBS المبرد. بعد ذلك ، قم بشفط CM-PBS ثم ماصة 6 ملليلتر من المخزن المؤقت المختزل فوق الخلايا ، واترك العينة على الجليد لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، استبدل الوسط ب 6 مل من المخزن المؤقت الطازج وضع العينة على الجليد لمدة 15 دقيقة إضافية.

هذه الخطوة حاسمة لأن الجلوتاثيون الموجود داخل المخزن المؤقت المختزل سوف يشق شقوق البيوتين المتبقية على سطح الخلية. هذا يضمن أن البروتينات الداخلية فقط هي التي سيتم تحيزها وتصنيفها.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الاختزال واستبدله ب 6 ملليلتر من مخزن التبريد. اترك العينة على الثلج لمدة 15 دقيقة أخرى وكرر خطوة التبريد مرة أخرى. بعد ذلك ، تخلص من مخزن التبريد واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 4 ملليلتر من PBS المبرد.

قم بشفط CM-PBS ثم اكشط الخلايا إلى 1 مليلتر من PBS المبرد باستخدام رافع الخلايا ، وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 غرام لمدة ثلاث دقائق. بعد ثلاث دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل.

اترك العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة ودوامة كل خمس دقائق. قم بالطرد المركزي للمحللات عند 14,000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات المنظفات والمواد القابلة للذوبان. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

باستخدام طرف ماصة مقطوع ، أضف 150 ميكرولترا من ملاط الستربتافيدين أغاروز إلى المحللة واحتضنه عند 4 درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات على شاكر. بعد ثلاث ساعات ، قم بحبيبات حبات الستربتافيدين الاغاروز عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخرزات في 1 مل من محلول الغسيل وهزها لمدة ثلاث دقائق عند 4 درجات مئوية. حبيبات الخرز وتخلص من المادة الطافية.

كرر هذه العملية أربع مرات أخرى لتقليل الارتباط غير المحدد للبروتينات العصارية الخلوية غير البيوتينية. بعد ذلك ، قم بتكسير الخرزات عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تخلص من مخزن الغسيل المغطى ، وأضف 50 ميكرولترا من مخزن التحميل 1x.

إطلاق البيوتين والستربتافيدين من الخرزات عن طريق تغيير الطبيعة عند 95 درجة مئوية. يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الداخلية فقط. بعد ذلك ، افصل المدخلات وسطح الخلية والكسور غير المنضمة بواسطة SDS-PAGE وقم بتحليلها بواسطة النشاف الغربي.