الفحص المجهري ثنائي الفوتون لدراسة انجذاب العملية الدبقية المجهرية نحو مركب في شريحة دماغ الفأر

ضع شريحة دماغ الفأر في غرفة نضح تحتوي على aCSF تحت مجهر ثنائي الفوتون.

تم تصميم الفأر وراثيا للتعبير عن GFP في الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يتيح تتبع حركة الخلايا الدبقية الصغيرة.

قم بتأمين الشريحة بحامل.

باستخدام إضاءة المجال الساطع ، حدد موقع منطقة الاهتمام.

قم بالتبديل إلى إضاءة التألق لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة.

املأ ماصة دقيقة بمركب الاختبار ، وقم بتثبيتها على حامل الحقنة ، وخفضها للمس الشريحة.

قم بتنشيط وضع التصوير ثنائي الفوتون ، مع تركيز ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة منخفض الطاقة في الأنسجة.

في النقطة المحورية لليزر ، يجمع فوتونان طاقتهما لإثارة GFP ، مما ينبعث منه تألق.

التقط صورا على مستويات Z متعددة للتركيز على عمليات الخلايا الدبقية الدقيقة.

سجل نشاط خط الأساس، ثم قم بحقن المركب وتابع التسجيل.

يرتبط المركب بمستقبلات الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يؤدي إلى مسارات الإشارات التي تدفع امتداد عملية الخلايا الدبقية الصغيرة نحو المصدر المركب.

راقب زيادة التألق بالقرب من موقع الحقن بمرور الوقت لتتبع الحركة.

30 دقيقة قبل بدء التسجيل ، قم بتوصيل المضخة التمعجية بغرفة تسجيل مخصصة مع نضح علوي وسفلي لتحسين الأكسجين وقابلية شرائح الأنسجة وتنظيف نظام التروية بالكامل ب 50 مل من الماء فائق النقاء. في نهاية دورة التنظيف، ابدأ نضح غرفة التسجيل ب 50 مل من aCSF في دورق زجاجي تحت كربوجين مستمر واستخدم ماصة نقل واسعة الفم يمكن التخلص منها لنقل الشريحة الأولى المراد تصويرها إلى الدورق لإزالة ورق العدسة.

عندما يغرق القسم إلى أسفل الدورق ، انقل القسم إلى غرفة التسجيل وضع حامل الشريحة على الشريحة لتقليل الحركة الناجمة عن تدفق التروية. استخدم إضاءة المجال الساطع لاستهداف منطقة الدماغ ذات الاهتمام تحت تكبير من 5 إلى 10 مرات. ثم استخدم هدفا 25 مرة مع عدسة غمر في الماء 0.35 مرة لضبط موضع مجال العرض.

استخدم الإضاءة المضان لتحديد موقع الخلايا الدبقية الدقيقة الفلورية وردم الماصة ب 10 ميكرولترات من aCSF التي تحتوي على المركب المورد محل الاهتمام عند تركيزه النهائي. وجه الطرف لأسفل مع الاهتزاز اللطيف لإزالة أي فقاعات هواء محاصرة في الطرف وتركيب الماصة المملوءة في حامل ماصة متصل بحقنة سعة 5 ملليلتر، مع وضع مكبس في موضع 5 ملليلتر ومثبتة على معالج دقيق ثلاثي المحاور.

اخفض الماصة برفق باتجاه الشريحة، وتحكم في الهدف واضبطه في نفس الوقت، حتى يلامس طرف الماصة سطح الشريحة برفق. الآن قم بضبط الليزر وقم بتبديل المجهر إلى وضع الفوتون المتعدد. تأكد من فحص الغرفة من أي مصدر ضوء وقم بتشغيل أجهزة الكشف غير الممسوحة ضوئيا. قم بتعيين الكسب واستخدم جدول بحث بحد أعلى مرمز بالألوان لتجنب تشبع وحدات البكسل في الصورة.

ثم ابدأ التسجيل لمدة إجمالية لا تقل عن 30 دقيقة، واضغط ببطء على مكبس المحقنة من وضع 5 إلى 1 ملليلتر بعد خمس دقائق على مدى 5 ثوان لتطبيق المركب على القسم. لتحليل الصور ، قم أولا بإجراء الإسقاط Z وتصحيح الانجراف باستخدام ImageJ على الملف محل الاهتمام. ثم افتح الملف المعدل في Icy وارسم منطقة اهتمام دائرية قطرها 35 ميكرومتر تتمحور حول موقع الحقن.

قم بتشغيل الفيلم مرة أخرى باستخدام عائد الاستثمار للتأكد من أنه في وضع جيد. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي Intensity Evolution لمنطقة الاهتمام لقياس متوسط الشدة بمرور الوقت في المنطقة ذات الاهتمام وحفظ النتائج كملف .xls.