FSL يبني : طريقة بسيطة لتعديل خلية / الفيريون السطوح مع مجموعة من العلامات البيولوجية دون أن يؤثر ذلك صلاحيتها

الهدف العام من هذا الإجراء هو وسم أسطح الخلايا الحية أو S بتركيبات نشطة بيولوجياً بشكل آمن وسريع. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير محلول من الفواصل الوظيفية، أو الدهون، أو تركيبات FSL. بعد ذلك، يتم خلط جزء متساوٍ من محلول التركيب مع جزء متساوٍ من محلول الخلايا أو VIRs.

كخطوة ثالثة، يتم تحضين الخليط لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وتتمثل الخطوة النهائية في غسل الخلايا المعدلة أو السيتات أو الـ VIRs المعدلة أو الـ VIRs واستخدامها تجريبياً كالمعتاد. وفي النهاية، يمكن تصور الخلايا الحية المعدلة سطحياً أو S من خلال جميع تقنيات التحليل التجريبية الروتينية، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والمجاهر والتلازن.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الوسم التساهمي في كونها سريعة وقوية ومرنة، ولا تؤثر على حيوية الخلية المعدلة أو Varian. لتحضير المحلول المخزون لتركيبة FSL أولاً، أضف واحد milliliter من المذيب إلى عبوة المنتج لإعادة تشكيل منتج FSL الجاف، مما ينتج محلولاً مخزوناً بتركيز واحد milligram per milliliter. قم بإجراء سونيكات للعبوة لمدة 30 ثانية، ثم قسم المحلول المخزون إلى عبوات معقمة سعة 100 microliter، واحفظ العبوات في درجة حرارة تتراوح بين اثنين إلى ثمانية degrees Celsius لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

لتحضير محاليل تركيبات FSL العاملة للإدراج قبل الاستخدام مباشرةً، قم بمعالجة المحلول بالموجات فوق الصوتية مرة أخرى لمدة 30 ثانية لضمان تجانس أي خلايا غير متجانسة، ثم خفف تركيب FSL والمحلول المنظم إلى التركيز المطلوب. تُحفظ المحاليل العاملة في درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع بعد إعادة تعليق الخلايا في وسط خالٍ من الدهون أو في PBS؛ ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي للخلايا المعدلة بـ FSL للتخلص من الدهون غير المرتبطة. بعد ذلك، قم بتجميع الخلايا في 100 µL من سائل التخفيف، واغسل خلايا المجموعات الضابطة تحت نفس الظروف باستخدام 100 µL من الخلايا غير المعدلة.

أضف 100 µL من تخفيف مناسب لمحلول FSL إذا رغبت في ذلك. وبالتوازي، قم أيضًا بإنشاء ضوابط سلبية باستخدام محلول FSL غير مرتبط و/أو PBS. ثم قم بحضن جميع المجموعات الفرعية للخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C بعد الحضن.

اغسل جميع الخلايا مرتين باستخدام وسط خالي من الدهون أو PBS لإزالة أي تركيبات FSL حرة، ثم قم بتحضير معلق مناسب في وسط خالي من الدهون. وبمجرد اكتمال عملية تعديل FSL، يمكن تخزين الخلايا في درجة حرارة تتراوح بين أربع إلى ثماني درجات مئوية. تتكون تركيبات FSL من ثلاثة مكونات رئيسية، وهي الرأس الوظيفي أو F، والذي يمكن أن يكون مجموعة متنوعة من المجموعات الوظيفية البيولوجية.

صُمم الفاصل RS لتحفيز تباعد الرأس الوظيفي عن الغشاء لتحسين التشتت المائي، وليكون غير تفاعلي مع المصل البشري ودهون DAL أو L، مما يسمح للبنية بالاندماج تلقائياً في الأسطح الأربعة. تظهر مجموعات FSL التمثيلية في الصور الخمس التالية. تم وسم أجنة الفئران الحية مباشرة بـ FSL fluorescein باستخدام طريقة الساعتين عند 37 °C في وسط زراعة خلايا خالٍ من المصل، ثم غُسلت وفُحصت تحت المجهر الفلوري.

في هذه الصورة الأولى، يمكن رؤية جنين مرآتي من خليتين خالٍ من zop palita. ويمثل التلوين الكثيف في منتصف الجنين تلوين الجسم القطبي التقليدي. وفي الصورتين التاليتين، تظهر هنا أجنة مرآتية من أربع خلايا وثماني خلايا خالية من zop palita، والتي تُظهر تلوينًا ظليًا للخلايا التي تقع خارج نطاق تركيز المجهر.

تظهر هذه الصورة الأخيرة لجنين مرآتي مكون من 16 خلية خالٍ من zop palita، وهو جنين مرآتي حي موسوم بـ FSL fluorescein. وتظهر في سلسلة الصور التالية أجنة مرآتية سليمة في اليوم الرابع إلى الخامس، حيث تم توسيم كل من الجنين وzop LUCITA. كما يظهر توسيم zebrafish باستخدام FSL fluorescein. وتوضح هذه الصورة الأولى تصويراً وعائياً مجهرياً ليرقة zebrafish بعد 52 ساعة من الإخصاب، حيث حُقن FSL fluorescein مباشرة في الدورة الدموية.

يمكن ملاحظة صبغ الأوعية الدموية لسمكة الزيبرا هنا. تم إنشاء خلايا أنسجة كلية سمكة الزيبرا غير المتجانسة (ZK cytes) المصبوغة بفلوريسين FSL خارج الجسم، ثم حُقنت مجهرياً في الدورة الدموية لسمكة زيبرا مستقبلة بعد 52 ساعة من الإخصاب. أُجريت ملاحظات حية لـ ZK cytes بعد ساعتين من الحقن عن طريق تصوير الأوعية الدموية تحت الفلورسين باستخدام المجهر الفاصل الزمني (time-lapse microscopy). يظهر هنا إطار فيديو واحد حيث تشير الأسهم البرتقالية إلى خلايا كبيرة بطيئة الحركة أو غير متحركة، بينما تشير الأسهم الخضراء إلى خلايا سريعة الحركة، والتي بدت ضبابية بسبب حركتها. تظهر هذه الصورة وسم فلوريسين FSL عن طريق الامتصاص الفموي للمركب، والذي تم تحقيقه من خلال غمر أجنة سمكة الزيبرا في أوساط تحتوي على فلوريسين FSL لمدة تصل إلى خمسة أيام.

تتوافق صورة المجهر الضوئي لأسماك zebrafish المعالجة بـ FSL fluorescein على اليسار مع الصورة الفلورية المجاورة لها على اليمين. وقد تركز الفلورسنس بشكل تفضيلي في القناة المعوية. ولم يُلاحظ أي تلوين في الأجنة الضابطة غير المعالجة الموضحة هنا.

يوضح الشكل هنا فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) الذي تم وسمه مباشرة باستخدام 10 µg/mL من فلوريسين FSL لمدة ساعتين عند 37 °C، يليه التثبيت بـ 4% بارافورمالدهيد، ثم التحليل بواسطة FastScan، والذي أظهر عدم وجود تنقية لجزيئات VSV بعد وسم FSL. يوضح هذا المخطط البياني خلايا خصية الخنازير المصابة بفيروسات H1N1 البشرية Puerto Rico 8 19 34 والمسومة بفلوريسين FSL.

تُمثّل الخلايا غير المصابة وغير الفلورية بالخط الأسود، بينما يشير الخط الأحمر إلى اندماج فيروس H1N1 مع خلايا الخنازير، وهو ما أدى إلى ظهور الفلورية. وفي هذه السلسلة التالية من الصور، تم وسم الخلايا أولاً باستخدام FSL biotin لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، ثم غُسلت وأُجريت لها تفاعلية مع avadon الموّسم بـ Fluor 4، ثم غُسلت وجُففت بالترطيب (wet mounted) للفحص بالمجهر الفلوري. تُظهر الصورة الأولى صورة مجمعة مجهرية بؤرية (confocal) لكيسة جنينية فئرانية (murine embryo blastocyst)، وتُظهر هذه الصورة مقطعاً بؤرياً مركزياً للجنين من الصورة السابقة.

تظهر هنا حيوانات منوية بشرية حية ومتحركة. ويحدث التشوش نتيجة لحركتها. ويمكن رؤية صورة تمثيلية أكثر وضوحًا لحيوانات منوية بشرية مثبتة في 4%Paraform aldehyde بعد الإدخال في هذا الشكل هنا.

تظهر كريات الدم الحمراء البشرية الموصومة بـ FSL biotin، حيث أن التثبيت باستخدام 4% paraformaldehyde قبل الإدخال لا يؤثر على وسم FSL كما هو موضح في الشكلين التاليين؛ هنا، يمكن ملاحظة خلايا RL 95 من سرطان بطانة الرحم البشري المثبتة بـ 4% parmal. بينما في هذه الصورة، تكون خلايا RL 95 من سرطان بطانة الرحم البشري غير مثبتة. ولا تُلاحظ فعلياً أي اختلافات في الوسم بين الصورتين، سواء مع التثبيت أو بدونه.

تظهر هنا على اليسار خلايا كريات دم حمراء (RBC) مُعلمة بـ FSL biotin تم رصدها في عينة دم سُحبت بعد ساعتين من الحقن الوريدي للخلايا، وقد عُرضت الخلايا تحت المجهر الضوئي على اليمين، بينما عُرض الحقل الخلوي ذاته تحت المجهر الفلوري، حيث يمكن تحديد الخليتين الموجودتين باللون الأخضر. ويمكن استخدام حساب نسبة الخلايا المُعلمة إلى الخلايا غير المُعلمة كمؤشر على البقاء. وتظهر صورة خلية FSL biotin المُعلمة الأخيرة خلايا بطانة رحم بشرية حية مُعلمة بـ biotin تم تصورها عن طريق الربط بحبيبات abated.

تظهر هذه السلسلة النهائية من الصور تفاعلات بنية FSL مع مؤشرات فصائل الدم. الصورة الأولى هي لخلايا GLI حمراء بشرية مغطاة بتركيز 500 microgram per milliliter من FSLG المختبرة مقابل تخفيفات من المصل البشري. لا تتفاعل الخلايا الحمراء البشرية بشكل طبيعي مع مستضد Xena GALI.

وبناءً على ذلك، يمكن استخدام الخلايا لتقدير مستويات الأجسام المضادة في المصل. في هذا المثال، تم تحديد عيار المستضد للمريض ليكون 1 إلى 32 عن طريق إنشاء خلايا بمستويات متناقصة من FSL. وعلى غرار تحديد عيار المستضد، يمكن تحديد المستوى الأمثل للمستضد للكشف عن الأجسام المضادة، كما يمكن إنشاء خلايا تعطي نتيجة إيجابية فقط عندما يتجاوز مستوى الأجسام المضادة عياراً محدداً.

يعتمد مستوى مستضد FSL المطلوب لإعطاء نتيجة إيجابية على جودة ومستوى الأجسام المضادة التي يتم الكشف عنها. وعادةً بالنسبة للمستضدات الكربوهيدراتية، فإن محلول FSL بتركيز 100 micrograms per milliliter سيؤدي إلى تفاعل إيجابي قوي. وتُعدى خلايا الدم الحمراء البشرية من المجموعة O لتكون ذات مستوى محدد من المستضد أو ما يسمى بالخلايا القياسية.

تُستخدم خلايا A لتقدير كمية antia في المصل البشري بدقة وقابلية للتكرار. في هذا المثال، تم تحضير الخلايا من كريات الدم الحمراء الخاصة بالمتبرع، ووُجد أن مستوى antia في مصل الفئة O الذي تم اختباره كان من 1 إلى 32. يظهر هنا في الأنبوب السادس استخدام مستضدات فصيلة الدم A و B التي أُدخلت في وقت واحد في عينة واحدة من كريات الدم الحمراء من الفئة O لإنشاء خلايا A ضعيفة و B ضعيفة.

يمكن استخدام هذه الخلايا لأغراض مراقبة جودة VO. حيث يعطي تحليل الخلايا المصاغة خصيصاً لـ "أسبوع A" و"أسبوع B" عند اختبارها ضد كواشف anti-A وanti-B التفاعلات الضعيفة المتوقعة كما هو موضح في هذا الشكل، مع حدوث التفاعلات في المنطقة السفلية الوسطى من الأنابيب. ويمكن تنفيذ هذه التقنية البسيطة في غضون ساعتين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.