تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في توضيح استخدام glycosate لإزالة السكريات إنزيمياً وتحليل الارتباط السكري من النوع n و O على بروتين سكري نموذجي. ويتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة البروتين السكري بـ PGA's F أو بمزيج إزالة السكريات من البروتين. كما تم تدعيم مزيج إزالة السكريات من البروتين بمزيج إضافي من exo glyco ass، والتي تساعد أحياناً في إزالة السكريات المقاومة.

نوضح هذه الطريقة باستخدام البروتين السكري النموذجي هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية المؤتلف بيتا، أو HCG beta، يليه تحليل SDS page، ثم صبغ بصبغة Kumasi blue وطريقة صبغ متخصصة للسكريات. تُستخدم Pro Q Emerald 300 من أجل تحليل الـ D glycosylated. تم الحصول على نتائج عينة HCG beta، والتي تظهر أن HCG beta يرتبط بالسكريات بشكل غير متجانس ويحتوي على أشكال سكرية متعددة بناءً على الاختلافات في هجرة البروتين مع وبدون معالجة glycosate وانخفاض الإشارة عند الصبغ بـ ProQ مع إزالة الغليكانات تباعاً.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل مطيافية الكتلة، في كونها بسيطة وتستخدم معدات مختبرية شائعة ومناسبة لعلماء بيولوجيا السكريات المبتدئين. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة محورية في مجال بيولوجيا السكريات، مثل معرفة ما إذا كان البروتين الخاص بي مرتبطاً بالسكريات. لبدء عملية إزالة السكريات إنزيمياً، قم بإذابة المحاليل المنظمة المرفقة من طقم إزالة السكريات من البروتين.

امزج الأنابيب جيداً واحفظها في درجة حرارة الغرفة. ضع القوارير التي تحتوي على الإنزيم على الثلج، وأذب محتويات قارورة HCG beta في 600 µL من الماء المقطر واحفظها على الثلج. بعد تحضير 1 mL من محلول one XG seven buffer عن طريق تخفيف المخزون 10 x في الماء المقطر، استخدم 25 µL لتخفيف 0.5 µL من PGA's f.

قم بتحضير خليط exo glycosate عن طريق دمج 2 µL من كل من أنواع exo glyco diseases الأربعة. بعد ذلك، أضف HCG beta و10 x glycoprotein denaturing buffer إلى سبعة أنابيب PCR مرقمة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، ثم أغلق الأنابيب وامزجها بلطف. قم بمسخ البروتينات في الجهاز الحراري (thermocycler) عن طريق التحضين لمدة 10 دقائق عند 94 °C، يليه تثبيت عند 4 °C. بعد إخراج الأنابيب من الجهاز الحراري، استخدم جهاز الطرد المركزي لإزالة أي تكثيف مرئي. أضف إلى كل أنبوب تفاعل الكواشف المتبقية وفقاً للبروتوكول المكتوب. أغلق أنابيب PCR باستخدام أغطية جديدة.

بعد ذلك، اخلط الأنابيب عن طريق النقر عليها بلطف أربع مرات بعد تدوير المحتويات لترسيبها، ثم ضع الأنابيب في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) واحضنها عند 37 °C لمدة أربع ساعات. يتبع ذلك تبريد العينات إلى 4 °C. ولإعداد الفصل الكهربائي لبروتينات SDS-PAGE، قم بتحضير محلول تحميل SDS المختزل بتركيز 3x طازج.

باستخدام DTT، أضف 12.5 µL من محلول تحميل SDS المختزل (بتركيز 3x) المُحضّر إلى كل عينة، ثم أغلق الأنابيب بأغطية جديدة وانقر عليها برفق للمزج. قم بتحضين الأنابيب في جهاز التدوير الحراري عند 94 °C لمدة خمس دقائق، ثم بردها إلى 4 °C. بعد التحضين، قم بتحميل 30 µL من كل عينة و10 µL من وسم البروتين على هلام tri glycine بتركيز 10 إلى 20%، مع حفظ المتبقي من كل عينة.

قم بإجراء الفصل الكهربائي للهلام عند 130 فولت حتى تصل جبهة الصبغة D إلى أسفل الهلام تقريباً. وعند انتهاء عملية الفصل، أخرج الهلام من القالب وضعه في صندوق بلاستيكي صغير يحتوي على كمية كافية من صبغة Coomassie blue لتغطية الهلام. اترك الهلام لمدة ساعة واحدة مع التحريك الخفيف بعد صبغه.

اغسل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة. في 50 milliliters من محلول detain، سجل الصور باستخدام جهاز transluminator للضوء الأبيض أو ماسح ضوئي. وبدلاً من ذلك، يمكن تجفيف الهلام بين شرائح من السيلوفان.

في إطار زمني محدد، قم بتشغيل المتبقي من كل عينة وعلامة بروتينية على هلام Tri glycine بنسبة 10 إلى 20% أثناء تشغيل الهلام. أذب كاشف ProQ emerald باستخدام DMF وقم بتحضير المحاليل المخزنة للتثبيت والغسيل والأكسدة اللازمة للصبغ باتباع دليل المنتج المرفق مع المجموعة. عند اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، قم بإزالة الهلام من القالب وضعه في صندوق بلاستيكي.

قم بتثبيت الهلام بإضافة 100 milliliters من محلول التثبيت المُحضّر. اترك الهلام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف، وفي اليوم التالي، اغسل الهلام باستخدام 100 milliliters من محلول الغسيل المُحضّر لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف، مع تكرار عملية الغسل مرة ثانية باستخدام محلول غسيل جديد.

بعد ذلك، قم بأكسدة الكربوهيدرات عن طريق تحضين الهلام مع الرج الخفيف لمدة 30 دقيقة في 25 milliliters من محلول الأكسدة المُحضّر، ثم اتبع التحضين بعمليتي غسل إضافيتين أثناء غسل الهلام. قم بتحضير صبغة ProQ emerald 300 طازجة عن طريق إضافة 500 microliters من محلول كاشف ProQ Emerald 300 إلى 25 milliliters من محلول التصبغ المنظم المرفق في الطقم. قم بتصبغ الهلام عن طريق التحضين في الصبغة المُحضّرة في ظروف مظلمة مع الرج الخفيف لمدة تتراوح من 90 إلى 120 دقيقة بعد تصبغ الهلام.

كرر خطوتي الغسيل كما هو موضح سابقاً. ثم سجل الصور باستخدام جهاز إضاءة خلفية للأشعة فوق البنفسجية (UV trans illuminator) عند 300 nanometers. وفي الخطوة النهائية، قارن صور الهلام المصبوغ بصبغة kumasi مع صور الهلام المصبوغ بصبغة ProQ emerald.

يمكن ملاحظة التغيرات في هجرة البروتين بعد إزالة السكريات إنزيميًا عند مقارنة عينة الضبط مع المعالجة F لـ PGA. ولإزالة غليكانات n، يتم استخدام مزيج إزالة السكريات لإزالة غليكانات n و O، ولا يُلاحظ أي نقص إضافي في الحجم بعد الهضم باستخدام glycosate إضافي. وبالإضافة إلى التغير في الكتلة، تصبح الحزم أكثر حدة مع إزالة الغليكانات.

من المرجح أن تمثل الحزمة التي تظهر تحت علامة 17 kilodalton ببتيد HCG beta منزوع الغليكوزيل بالكامل. وتظهر المسارات من خمسة إلى سبعة الحزم المقابلة لـ Glyco. وقد تنشأ الحزم الأخرى عن عملية نزع غليكوزيل غير مكتملة أو من بروتينات متعددة غير محددة موجودة في عينة HCG beta.

يعمل كاشف الأخضر الزمردي على أكسدة وصبغ جميع الغليكانات الموجودة في جزيء البروتين. وبناءً على ذلك، تنخفض شدة الإشارة مع إزالة الغليكوزيل إنزيميًا من HCG beta. وتشير الإشارة المتبقية في المسارين الثالث والرابع إلى وجود أنماط غليكانية مقاومة للإنزيمات المستخدمة.

يُستخدم الغليكوزات الإضافي في المسار الرابع. قم بإزالة بضعة بقايا سكر إضافية. يظل هجرة البروتين كما هي، ولكن يمكن ملاحظة انخفاض طفيف في كثافة التصبيغ.

لم تكن مجموعات السكر المقاومة موجودة في جميع أنواع البروتينات. لم يتم اكتشاف بعض النطاقات بواسطة صبغة emerald Green مما يشير إلى أنها خضعت لإزالة السكر بشكل مكثف. وتدعم البيانات الإضافية الاستنتاج بأن HCG beta يمتلك غلكزة غير متجانسة. يظهر النطاق السفلي في المسار الثاني باهتاً في صورة emerald green.

بينما تبدو الحزمة العلوية في المسار الثاني ساطعة، مما يشير إلى أن العديد من مجموعات GLYCAN لا تزال موجودة، فإن هذه البيانات تدعم الاستنتاج بأن HCG beta المؤتلف الذي يتم التعبير عنه في خلايا الفأر يحتوي على أشكال سكرية متعددة بسبب عدم التجانس المتأصل في عملية الارتباط بالجليكان. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مطيافية الكتلة للإجابة على أسئلة إضافية مثل: ما هو معدل الإشغال؟ وما هو مدى الارتباط بالجليكان، أو ما هو التركيب الدقيق للجليكانات؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام glycosylate لإزالة السكريات إنزيميًا وتحليل الغليكانات المرتبطة بـ NNO على البروتينات السكرية. قد يكون اختيار طريقة الكشف أمرًا صعبًا لأن مناطق صبغ البروتين تكون مفيدة فقط إذا أدى إزالة السكريات إلى إزاحة كبيرة في الكتلة الجزيئية للبروتينات الأخرى.

لقد لاحظنا وجود هجرات غير طبيعية بعد إزالة السكريات، ووجدنا أن أي تغير في الهجرة يعد دليلاً على أن البروتين قد خضع لعملية إزالة السكريات.