كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية
يونيو 9, 2012
قمنا بتطوير بروتوكول جديد لتحسين كفاءة المختبر في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية. حصلت على خلايا ES متباينة الخلايا العصبية الحركية يتميز كما يتضح من التعبير عن علامات الخلايا العصبية الحركية والخلايا العصبية باستخدام تقنيات المناعى.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية. أول فأر مزرعة ، وخلايا جذعية جنينية على الخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأر ، ومكملات مع عامل مثبط لسرطان الدم. ثم قم بتحسين عملية التطبيع عن طريق إضافة مواصفات الخلايا العصبية الحركية noggin BFG F و FGF ثمانية عن طريق الحضانة بحمض الريتينويك وناهض سلس ، والذي يتبعه استطالة المحور العصبي ونضوج الخلايا العصبية الحركية.
أخيرا ، استخدم الفحص المجهري المناعي لفحص خلايا MES المتمايزة التي تعبر عن مضان GFP قوي أدى توليد كميات كبيرة من الخلايا العصبية الحركية إلى تسهيل البحث في أمراض الخلايا العصبية الحركية مقارنة بالبروتوكولات الحالية الحالية. هذا النهج المتمثل في تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية أكثر كفاءة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لضمور العضلات الشوكي.
يمكن تطبيقه أيضا على أمراض الخلايا العصبية الحركية الأخرى مثل التصلب الجانبي الضموري لطلاء الخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأر الجنيني تغطى أربعة أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم مع ثمانية ملليلتر من محلول الجيلاتين 0.1٪. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تخلص من السائل الزائد. الآن قم بتخفيف قارورة واحدة من mitomycin C في PMEF المنشط إلى 40 مل من لوحة وسائط PMEF على الألواح الأربعة والزراعة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
بعد ذلك ، قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا MES في حمام مائي بزاوية 37 درجة. اغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من وسائط E ES في أنبوب سعة 15 مل. بعد الطرد المركزي عند 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
استنشق المادة الطافية وأعد تعليق خلايا MES في 20 مل من وسائط ES مع عامل مثبط لسرطان الدم المضاف حديثا. استمر في إزالة 10 ملليلتر من الوسائط من مزارع PMEF واستبدلها ب 10 ملليلتر من معلق الخلايا HBG الثلاث ES. راقب تطور خلايا MES بمرور الوقت من مستعمرات صغيرة في 24 ساعة إلى مستعمرات يبلغ قطرها حوالي 100 ميكرومتر بعد 72 ساعة من الطلاء.
استبدال الوسائط يوميا للحفاظ على تكاثر الخلايا لتحريض خلايا MES. التمايز إلى الخلايا العصبية الحركية. يجب أولا فصل الخلايا الجذعية الجنينية للفأر عن الخلايا المغذية PMEF ثم زراعتها في بيئة معلقة في يوم الحث.
لكل ثقافة ES 100 ملم ، قم بإعداد قارورة T one 50 المغلفة بجيلاتين 0.1٪ بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الجيلاتين الزائد واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. استمر في استنشاق وسائل الإعلام بعناية من ثقافة ES ، مع التأكد من عدم إزاحة المستعمرات غير المرتبطة. ثم اغسل مرة واحدة مع 10 مل PBS.
الآن لفصل خلايا MES عن PMEF ، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA واحتضنه لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. عند 37 درجة مئوية ، تحقق من انفصال الخلايا الجذعية و PMEF عن اللوحة. ثم أضف 15 مل من وسائط ES الطازجة وقم بتعطيل المستعمرات عن طريق سحب العينات.
انقل تعليق الخلية إلى حضنة قارورة T واحدة 50 مطلية بالجيلاتين المحضرة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى يعلق PFS على السطح الجيلاتيني. الآن حصاد خلايا MES العائمة في أنبوب 50 مليلتر وحبيبات عن طريق التمركز. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من التمايز العصبي.
تعداد متوسط باستخدام مقياس الخلوي الدموي ثم اللوحة على طبق ثقافة تعليق 100 ملم عند التمايز. في اليوم الأول ، تحقق عن طريق المجهر من أن خلايا MES قد شكلت مجاميع عائمة صغيرة تسمى الأجسام الجنينية. نظرا لأن أي PMEF مرحل متصل بالطبق ، انقل خلايا التعليق والوسائط ES إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، ثم جهاز الطرد المركزي بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق.
لحصاد الأجسام الجنينية ، قم بالشفط من الوسائط ، أضف بعناية 10 مل من التمايز العصبي الطازج ، المتوسط إلى ebs المحبب ، ثم الخلايا الصفيحية في ثقافة طبق بكتيرية جديدة لمدة 24 ساعة عند التمايز. في اليوم الثاني ، قم بتدوير طبق الثقافة وانقل الوسائط و EBS إلى أنبوب سعة 15 مل. دع EBS يستقر عن طريق الجاذبية ، ثم استنشق الوسط بعناية EBS و 10 ملليلتر من تمايز الخلايا العصبية الحركية.
ثقافة متوسطة EBS في طبق بكتيري جديد لمدة خمسة أيام على التمايز. في اليوم السابع ، تحقق من أن EBS يبلغ قطره حوالي 150 إلى 200 ميكرومتر ويعبر عن إشارات GFP قوية عند التمايز. في اليوم الخامس ، قبل يومين من فصل EBS ، ضع زلات غطاء دائري مقاس 12 ملم في قاع صفيحة 24 بئر.
ثم أضف 0.5 مل من 100 ميكروغرام لكل مليلتر ، بولي DL ornithine ، واحتضن عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بشفط ألواح بولي DL ornithine الجافة بالهواء وقم بتغطية زلات في غطاء زراعة الأنسجة. شطف الآبار لوحة بالماء المقطر المزدوج ثلاث مرات.
اترك الهواء يجف لتغطية زلات الغطاء. قم بعمل تخفيف جديد من اثنين ميكروغرام لكل مليلتر من لامينين الفأر في خمسة ملليلتر من المثلج البارد واحد XPBS. أضف 0.5 مل لكل بئر واحتضن عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
يغسل مرتين باستخدام PBS عند التمايز. في اليوم السابع ، اجمع EBS في أنبوب سعة 15 مليلتر واترك EBS يستقر عن طريق الجاذبية. بعد أربع غسلات باستخدام PBS ، أضف ملليلترا واحدا من ACU max إلى EBS واخلطه برفق واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق ACU الزائد الذي يغطي ebs.
أضف الآن ثلاثة ملليلتر من وسط MND وفصل EBS عن طريق سحب الماصات 20 مرة تقريبا باستخدام ماصة صغيرة سعة مليلتر واحد ، ثم احتضانها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتمرير تعليق الخلية عبر غطاء مدرب الخلية في أنبوب 12 × 75 ملم. كرر خطوة التفكك هذه مع الكتل والخلايا المتبقية التي يحتفظ بها المرشح لإثراء إنتاجية الخلايا المفردة في معلق خلية واحدة نهائي من ستة ملليلتر. امزج برفق معلق الخلية المفردة وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي المخفف في وسط MND كامل بكثافة مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل لوحة مليلتر.
0.5 ملليلتر معلق خلية لكل بئر من ألواح 24 البئر المحضرة التي تحتوي على زلات غطاء مطلية ببولي DL ornithine laminin. تمتد الخلايا المتمايزة العصبية الطويلة بعد يومين. في الثقافة ، HBG three عبارة عن خط خلية ES مشتق من فأر معدل وراثيا يعبر عن EGFP تحت سيطرة محفز خاص بالخلايا العصبية الحركية HB تسعة مع بروتوكول تمايز محدد.
يمكن استخدام خلايا MES لاشتقاق الخلايا العصبية الحركية. تشكل خلايا MES غير المتمايزة مستعمرات مستديرة أعلى طبقة تغذية الليفية. لديهم تعبير GFP ضعيف.
تم فصل خلايا MES هذه عن طبقات التغذية وزراعتها على أطباق منخفضة التعلق لتشكيل أجسام جنينية. عبرت خلايا MES المتمايزة عن مضان GFP قوي بعد اليوم السابع. تم فصل EBS التمايز وطلاءه على ألواح مطلية ببولي DL ornithine laminin.
تمتد الخلايا المتمايزة إلى الخلايا العصبية الطويلة من أجسام الخلايا المطلية بعد يومين في الثقافة ، ويمكن تمييز الخلايا العصبية الحركية المشتقة من خلايا MES بتلطيخ التألق المناعي. تعبر هذه الخلايا الإيجابية GFP عن الخيوط العصبية لعلامة الخلايا العصبية وعلامتي الخلايا العصبية الحركية. الجفن واحد والكولين أسيتيل ترانسفيراز DPI بقع النوى المأخوذة معا.
يوفر بروتوكول التمايز المكون من خطوتين طريقة فعالة لتفريق خلايا MES إلى خلايا عصبية حركية في العمود الفقري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية التفريق بكفاءة بين الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية. في الختام ، تذكر أن الصفات العالية للخلايا الجذعية الجنينية للفأر هي المعلمة الأكثر أهمية لتوليد الخلايا العصبية الحركية بكفاءة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً جديداً لتفاضل فعال لخلايا جذعية جنينية فئرانية إلى الخلايا العصبية الحركية. تظهر الخلايا المتمايزة خصائص الخلايا العصبية الحركية، مؤكدة من خلال التعبير عن علامات محددة من خلال تقنيات المناعة النسيجية المناعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- بحوث الخلايا العصبية الحركية
الخلفية
- تشكل أمراض الخلايا العصبية الحركية تحديات كبيرة في البحوث.
- البروتوكولات الحالية للتفاضل غالباً ما تكون غير فعالة.
- تحسين طرق التفاضل يمكن أن يعزز نتائج البحوث.
- الخلايا الجذعية الجنينية الفئرانية هي نموذج قيم لدراسة الخلايا العصبية الحركية.
هدف الدراسة
- لتطوير بروتوكول أكثر فعالية لتفاضل الخلايا الجذعية الجنينية الفئرانية إلى الخلايا العصبية الحركية.
- لتسهيل البحث في أمراض الخلايا العصبية الحركية.
- لتوفير رؤى حول حالات مثل ضمور العضلات الشوكي.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا الجذعية الجنينية الفئرانية على الخلايا الليفية الجنينية الفئرانية الأولية.
- تقوية المزروعات بعامل تثبيط ابيضاض الدم.
- إضافة noggin، BFGF، وFGF8 لحث تحديد الخلايا العصبية الحركية.
- استخدام حمض الريتينويك وناهض smoothened للنضج وإطالة المحور العصبي.
النتائج الرئيسية
- تفاضل ناجح للخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا العصبية الحركية.
- تأكيد التعبير عن علامات الخلايا العصبية الحركية عبر ميكروسكوب المناعة الملون.
- توليد كميات كبيرة من الخلايا العصبية الحركية لأغراض البحث.
- كفاءة محسنة مقارنة بالبروتوكولات الحالية.
الاستنتاجات
- البروتوكول الجديد يحسن بشكل كبير عملية التفاضل.
- يمكن لهذه الطريقة أن تتقدم في فهم أمراض الخلايا العصبية الحركية.
- يمكن للبحوث المستقبلية الاستفادة من هذا البروتوكول للحصول على رؤى علاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons addresses a critical bottleneck in disease modeling and early drug discovery for neurodegenerative disorders. This protocol enhances predictive confidence in generating disease-relevant cell types, supporting translational research and target validation for motor neuron diseases such as SMA and ALS. Improved differentiation efficiency enables scalable production of functional motor neurons, facilitating robust phenotypic screening and mechanistic de-risking in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables generation of disease-relevant motor neurons for hypothesis-driven target interrogation.
- Supports functional validation of candidate targets in a controlled stem cell-derived system.
- Improves mechanistic de-risking by providing reproducible neural differentiation outputs.
- Facilitates portfolio triage by enabling early-stage assessment of neurotoxicity and efficacy.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized source of motor neurons for high-content phenotypic screening.
- Enables quantitative assay development using GFP and immunofluorescent marker readouts.
- Supports reproducibility and scalability for compound evaluation workflows.
- Prepares validated cell systems for downstream screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro disease models with translational biomarker strategies for motor neuron disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using functionally characterized neurons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust, disease-relevant data.
- Enhances predictive value for therapeutic candidate selection in neurodegenerative disease pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This two-step differentiation protocol integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable generation of motor neurons for target validation, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in motor neuron disease models.
- Screening: Delivers assay-ready, marker-validated motor neurons for reproducible compound testing.
- Analytics: Provides quantitative outputs via GFP expression and immunofluorescent marker analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through disease-relevant cell systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for motor neuron generation across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Standardizes differentiation protocols for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and neural differentiation protocols.
- Needs access to fluorescence microscopy and immunostaining infrastructure for marker validation.
- Demands cross-team standardization to ensure reproducibility of differentiation efficiency.
- May require adaptation for different stem cell lines or disease models.
- Dependent on high-quality starting stem cell populations for optimal outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Culturing Mouse Embryonic Stem Cells (Timing: 3 days)
2:34
Neural Induction (Timing: 2 days)
4:48
Motor Neuron Specification (Timing: 5 days)
5:24
Preparation of Poly-DL-Ornithine/Laminin Coated Coverslips (Timing: 2 days)
6:18
Axon Elongation (Timing: 2 days)
7:47
Results: mES Cell Differentiation into Motor Neurons
9:12
Conclusion
