كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية. أول فأر مزرعة ، وخلايا جذعية جنينية على الخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأر ، ومكملات مع عامل مثبط لسرطان الدم. ثم قم بتحسين عملية التطبيع عن طريق إضافة مواصفات الخلايا العصبية الحركية noggin BFG F و FGF ثمانية عن طريق الحضانة بحمض الريتينويك وناهض سلس ، والذي يتبعه استطالة المحور العصبي ونضوج الخلايا العصبية الحركية.

أخيرا ، استخدم الفحص المجهري المناعي لفحص خلايا MES المتمايزة التي تعبر عن مضان GFP قوي أدى توليد كميات كبيرة من الخلايا العصبية الحركية إلى تسهيل البحث في أمراض الخلايا العصبية الحركية مقارنة بالبروتوكولات الحالية الحالية. هذا النهج المتمثل في تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية أكثر كفاءة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لضمور العضلات الشوكي.

يمكن تطبيقه أيضا على أمراض الخلايا العصبية الحركية الأخرى مثل التصلب الجانبي الضموري لطلاء الخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأر الجنيني تغطى أربعة أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم مع ثمانية ملليلتر من محلول الجيلاتين 0.1٪. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تخلص من السائل الزائد. الآن قم بتخفيف قارورة واحدة من mitomycin C في PMEF المنشط إلى 40 مل من لوحة وسائط PMEF على الألواح الأربعة والزراعة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

بعد ذلك ، قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا MES في حمام مائي بزاوية 37 درجة. اغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من وسائط E ES في أنبوب سعة 15 مل. بعد الطرد المركزي عند 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

استنشق المادة الطافية وأعد تعليق خلايا MES في 20 مل من وسائط ES مع عامل مثبط لسرطان الدم المضاف حديثا. استمر في إزالة 10 ملليلتر من الوسائط من مزارع PMEF واستبدلها ب 10 ملليلتر من معلق الخلايا HBG الثلاث ES. راقب تطور خلايا MES بمرور الوقت من مستعمرات صغيرة في 24 ساعة إلى مستعمرات يبلغ قطرها حوالي 100 ميكرومتر بعد 72 ساعة من الطلاء.

استبدال الوسائط يوميا للحفاظ على تكاثر الخلايا لتحريض خلايا MES. التمايز إلى الخلايا العصبية الحركية. يجب أولا فصل الخلايا الجذعية الجنينية للفأر عن الخلايا المغذية PMEF ثم زراعتها في بيئة معلقة في يوم الحث.

لكل ثقافة ES 100 ملم ، قم بإعداد قارورة T one 50 المغلفة بجيلاتين 0.1٪ بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الجيلاتين الزائد واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. استمر في استنشاق وسائل الإعلام بعناية من ثقافة ES ، مع التأكد من عدم إزاحة المستعمرات غير المرتبطة. ثم اغسل مرة واحدة مع 10 مل PBS.

الآن لفصل خلايا MES عن PMEF ، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA واحتضنه لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. عند 37 درجة مئوية ، تحقق من انفصال الخلايا الجذعية و PMEF عن اللوحة. ثم أضف 15 مل من وسائط ES الطازجة وقم بتعطيل المستعمرات عن طريق سحب العينات.

انقل تعليق الخلية إلى حضنة قارورة T واحدة 50 مطلية بالجيلاتين المحضرة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى يعلق PFS على السطح الجيلاتيني. الآن حصاد خلايا MES العائمة في أنبوب 50 مليلتر وحبيبات عن طريق التمركز. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من التمايز العصبي.

تعداد متوسط باستخدام مقياس الخلوي الدموي ثم اللوحة على طبق ثقافة تعليق 100 ملم عند التمايز. في اليوم الأول ، تحقق عن طريق المجهر من أن خلايا MES قد شكلت مجاميع عائمة صغيرة تسمى الأجسام الجنينية. نظرا لأن أي PMEF مرحل متصل بالطبق ، انقل خلايا التعليق والوسائط ES إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، ثم جهاز الطرد المركزي بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق.

لحصاد الأجسام الجنينية ، قم بالشفط من الوسائط ، أضف بعناية 10 مل من التمايز العصبي الطازج ، المتوسط إلى ebs المحبب ، ثم الخلايا الصفيحية في ثقافة طبق بكتيرية جديدة لمدة 24 ساعة عند التمايز. في اليوم الثاني ، قم بتدوير طبق الثقافة وانقل الوسائط و EBS إلى أنبوب سعة 15 مل. دع EBS يستقر عن طريق الجاذبية ، ثم استنشق الوسط بعناية EBS و 10 ملليلتر من تمايز الخلايا العصبية الحركية.

ثقافة متوسطة EBS في طبق بكتيري جديد لمدة خمسة أيام على التمايز. في اليوم السابع ، تحقق من أن EBS يبلغ قطره حوالي 150 إلى 200 ميكرومتر ويعبر عن إشارات GFP قوية عند التمايز. في اليوم الخامس ، قبل يومين من فصل EBS ، ضع زلات غطاء دائري مقاس 12 ملم في قاع صفيحة 24 بئر.

ثم أضف 0.5 مل من 100 ميكروغرام لكل مليلتر ، بولي DL ornithine ، واحتضن عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بشفط ألواح بولي DL ornithine الجافة بالهواء وقم بتغطية زلات في غطاء زراعة الأنسجة. شطف الآبار لوحة بالماء المقطر المزدوج ثلاث مرات.

اترك الهواء يجف لتغطية زلات الغطاء. قم بعمل تخفيف جديد من اثنين ميكروغرام لكل مليلتر من لامينين الفأر في خمسة ملليلتر من المثلج البارد واحد XPBS. أضف 0.5 مل لكل بئر واحتضن عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

يغسل مرتين باستخدام PBS عند التمايز. في اليوم السابع ، اجمع EBS في أنبوب سعة 15 مليلتر واترك EBS يستقر عن طريق الجاذبية. بعد أربع غسلات باستخدام PBS ، أضف ملليلترا واحدا من ACU max إلى EBS واخلطه برفق واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق ACU الزائد الذي يغطي ebs.

أضف الآن ثلاثة ملليلتر من وسط MND وفصل EBS عن طريق سحب الماصات 20 مرة تقريبا باستخدام ماصة صغيرة سعة مليلتر واحد ، ثم احتضانها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتمرير تعليق الخلية عبر غطاء مدرب الخلية في أنبوب 12 × 75 ملم. كرر خطوة التفكك هذه مع الكتل والخلايا المتبقية التي يحتفظ بها المرشح لإثراء إنتاجية الخلايا المفردة في معلق خلية واحدة نهائي من ستة ملليلتر. امزج برفق معلق الخلية المفردة وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي المخفف في وسط MND كامل بكثافة مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل لوحة مليلتر.

0.5 ملليلتر معلق خلية لكل بئر من ألواح 24 البئر المحضرة التي تحتوي على زلات غطاء مطلية ببولي DL ornithine laminin. تمتد الخلايا المتمايزة العصبية الطويلة بعد يومين. في الثقافة ، HBG three عبارة عن خط خلية ES مشتق من فأر معدل وراثيا يعبر عن EGFP تحت سيطرة محفز خاص بالخلايا العصبية الحركية HB تسعة مع بروتوكول تمايز محدد.

يمكن استخدام خلايا MES لاشتقاق الخلايا العصبية الحركية. تشكل خلايا MES غير المتمايزة مستعمرات مستديرة أعلى طبقة تغذية الليفية. لديهم تعبير GFP ضعيف.

تم فصل خلايا MES هذه عن طبقات التغذية وزراعتها على أطباق منخفضة التعلق لتشكيل أجسام جنينية. عبرت خلايا MES المتمايزة عن مضان GFP قوي بعد اليوم السابع. تم فصل EBS التمايز وطلاءه على ألواح مطلية ببولي DL ornithine laminin.

تمتد الخلايا المتمايزة إلى الخلايا العصبية الطويلة من أجسام الخلايا المطلية بعد يومين في الثقافة ، ويمكن تمييز الخلايا العصبية الحركية المشتقة من خلايا MES بتلطيخ التألق المناعي. تعبر هذه الخلايا الإيجابية GFP عن الخيوط العصبية لعلامة الخلايا العصبية وعلامتي الخلايا العصبية الحركية. الجفن واحد والكولين أسيتيل ترانسفيراز DPI بقع النوى المأخوذة معا.

يوفر بروتوكول التمايز المكون من خطوتين طريقة فعالة لتفريق خلايا MES إلى خلايا عصبية حركية في العمود الفقري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية التفريق بكفاءة بين الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا عصبية حركية. في الختام ، تذكر أن الصفات العالية للخلايا الجذعية الجنينية للفأر هي المعلمة الأكثر أهمية لتوليد الخلايا العصبية الحركية بكفاءة.