والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الأدوية الجديدة التي تعدل قنوات grk. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء خلايا A TT 20 أولا في لوحة البئر 96. الخطوة الثانية هي تخفيف مركبات الاختبار باستخدام نظام مناولة الألواح السائلة Verset.

بعد ذلك ، يتم تطبيق مركبات الاختبار المخففة على الخلايا باستخدام verset. تتمثل الخطوة الأخيرة في إدخال لوحة البئر 96 في قارئ الألواح الفلورية Synergy ، وحقن محاليل التحكم والسوماتوستاتين في الآبار. في النهاية ، يتم استخدام قارئ لوحة الفلورسنت لإظهار المركبات التي تغير إشارة الفلورسنت التي يسببها السوماتوستاتين وبالتالي تعدل قنوات Grk.

تتمثل ميزة هذا الإجراء على الطرق الحالية مثل تسجيل مشبك التصحيح في أنه يمكن فحص عدد كبير من المركبات بسرعة لتحديد ما إذا كانت تعدل قنوات gerk. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الألم لأن المركبات التي تنشط قناة Gerk ، والتي تؤدي إلى تثبيط انتقال FI المسبب للألم ، يمكن تحديدها لتوضيح إجراء الطلاء. ألواح الآبار البالغ عددها 96 وطلاء الخلايا هي ماريبيل فاسكيز.

طالب في مختبري ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة خلايا الغدة النخامية A TT 20 في DMEM مكملة بمصل حصان بنسبة 10٪ عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2. حافظ على الثقافة عن طريق زراعة الخلايا كل خمسة إلى سبعة أيام باستخدام إجراء قياسي. بعد ذلك ، قم بتغطية آبار الأسود الصافية.

صفيحة بئر 96 سفلية مع 50 ميكرولتر من بولي ليسين. اترك الآبار تجف لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. ثم قم بإزالة لوحة بولي L lysine الزائدة في الخلايا الموجودة في لوحة البئر 96 التي تحتوي على 200 ميكرولتر من الوسائط بكثافة 30 ، 000 خلية لكل بئر.

بعد ذلك ، قم بتخزين الخلايا في الحاضنة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. استخدم إعداد الشفط لشفط وسط المزرعة ببطء من الطبقة الأحادية للخلية ، ثم اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من محلول العازلة العادي. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المحلول العازل الذي يحتوي على صبغة حساسة لإمكانات الغشاء لكل منها.

احتضان الخلايا جيدا لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 40 دقيقة ، قم بإزالة خلايا A TT 20 من الحاضنة واسمح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة ، واستنشق المخزن المؤقت القديم. ثم قم بتطبيق محلول عازل جديد يحتوي على MPD على الخلايا.

بعد ذلك ، استخدم نظام معالجة السوائل لتطبيق تركيزات مختلفة من مركبات الاختبار ومحاليل التحكم على الخلايا. في لوحة البئر 96 ، تحتضن الخلايا لمدة خمس دقائق مع مركبات الاختبار لقياسات الفلورسنت. في هذا الإجراء ، أدخل لوحة البئر 96 في قارئ لوحة الفلورسنت التآزر للتكنولوجيا الحيوية.

احصل على إشارة خلفية الفلورسنت بطول موجة نضح يبلغ 520 نانومتر وطول موجة مهمة يبلغ 560 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتطبيق روابط G PCR R أو محلول التحكم على الآبار لتنشيط قنوات GIR باستخدام نظام حاقن Synergy two. ثم اجمع نقاط البيانات على فترات عشر ثوان خلال فترة أخذ العينات 302.

عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث. احسب عامل Z لتحديد موثوقية المقايسة. تشير عوامل Z في النطاق من 0.5 إلى 1.0 إلى أن جودة الفحص ممتازة.

يتم استبعاد اللوحات ذات عوامل Z أقل من 0.5. من التحليل ، يتم إعادة اختبار المركبات التي تعدل إشارة الفلورسنت في وجود اثنين من كلوريد الباريوم المليمولار أو 500 نانو تيرابين مولار Q لتأكيد خصوصية قناة البوتاسيوم للمعدل الداخلي الموضحة هنا هي إشارة فلورية تمثيلية HLB 0 2 1 1 15 2 تم قياسها بمرور الوقت في خلايا A TT 20 مع إضافة السوماتوستاتين أو محلول التحكم. تم حساب نسبة شدة الفلورسنت في المحور Y بقسمة الإشارة في وجود السوماتوستاتين أو محلول التحكم على إشارة خط الأساس المقاسة قبل إضافة السوماتوستاتين أو محلول التحكم.

يظهر هنا علاج خلايا A TT 20 مع 500 أضراس نانو. يمنع تيرابين Q الانخفاض بوساطة السوماتوستاتين في إشارة الفلورسنت عن طريق ربط اثنين وحجب قنوات G. ويظهر هنا علاج خلايا A TT 20 ب 20 ميكرومولار بروبافينون ، والذي يثبط أيضا الانخفاض بوساطة السوماتوستاتين في إشارة الفلورسنت بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على الأدوية التي تعدل قنوات grk باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت.