والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK
أبريل 24, 2012
إجراء فحص في الوقت الحقيقي لتحديد الأدوية التي تتفاعل مع بروتين G-K بوابات المعدل نحو الداخل + (GIRK) قنوات. الفحص يستخدم غشاء المحتملة التي تراعي الأصباغ الفلورية لقياس نشاط GIRK قناة. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف للاستخدام على عدد من خطوط الخلايا.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الأدوية الجديدة التي تعدل قنوات grk. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء خلايا A TT 20 أولا في لوحة البئر 96. الخطوة الثانية هي تخفيف مركبات الاختبار باستخدام نظام مناولة الألواح السائلة Verset.
بعد ذلك ، يتم تطبيق مركبات الاختبار المخففة على الخلايا باستخدام verset. تتمثل الخطوة الأخيرة في إدخال لوحة البئر 96 في قارئ الألواح الفلورية Synergy ، وحقن محاليل التحكم والسوماتوستاتين في الآبار. في النهاية ، يتم استخدام قارئ لوحة الفلورسنت لإظهار المركبات التي تغير إشارة الفلورسنت التي يسببها السوماتوستاتين وبالتالي تعدل قنوات Grk.
تتمثل ميزة هذا الإجراء على الطرق الحالية مثل تسجيل مشبك التصحيح في أنه يمكن فحص عدد كبير من المركبات بسرعة لتحديد ما إذا كانت تعدل قنوات gerk. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الألم لأن المركبات التي تنشط قناة Gerk ، والتي تؤدي إلى تثبيط انتقال FI المسبب للألم ، يمكن تحديدها لتوضيح إجراء الطلاء. ألواح الآبار البالغ عددها 96 وطلاء الخلايا هي ماريبيل فاسكيز.
طالب في مختبري ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة خلايا الغدة النخامية A TT 20 في DMEM مكملة بمصل حصان بنسبة 10٪ عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2. حافظ على الثقافة عن طريق زراعة الخلايا كل خمسة إلى سبعة أيام باستخدام إجراء قياسي. بعد ذلك ، قم بتغطية آبار الأسود الصافية.
صفيحة بئر 96 سفلية مع 50 ميكرولتر من بولي ليسين. اترك الآبار تجف لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. ثم قم بإزالة لوحة بولي L lysine الزائدة في الخلايا الموجودة في لوحة البئر 96 التي تحتوي على 200 ميكرولتر من الوسائط بكثافة 30 ، 000 خلية لكل بئر.
بعد ذلك ، قم بتخزين الخلايا في الحاضنة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. استخدم إعداد الشفط لشفط وسط المزرعة ببطء من الطبقة الأحادية للخلية ، ثم اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من محلول العازلة العادي. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المحلول العازل الذي يحتوي على صبغة حساسة لإمكانات الغشاء لكل منها.
احتضان الخلايا جيدا لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 40 دقيقة ، قم بإزالة خلايا A TT 20 من الحاضنة واسمح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة ، واستنشق المخزن المؤقت القديم. ثم قم بتطبيق محلول عازل جديد يحتوي على MPD على الخلايا.
بعد ذلك ، استخدم نظام معالجة السوائل لتطبيق تركيزات مختلفة من مركبات الاختبار ومحاليل التحكم على الخلايا. في لوحة البئر 96 ، تحتضن الخلايا لمدة خمس دقائق مع مركبات الاختبار لقياسات الفلورسنت. في هذا الإجراء ، أدخل لوحة البئر 96 في قارئ لوحة الفلورسنت التآزر للتكنولوجيا الحيوية.
احصل على إشارة خلفية الفلورسنت بطول موجة نضح يبلغ 520 نانومتر وطول موجة مهمة يبلغ 560 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتطبيق روابط G PCR R أو محلول التحكم على الآبار لتنشيط قنوات GIR باستخدام نظام حاقن Synergy two. ثم اجمع نقاط البيانات على فترات عشر ثوان خلال فترة أخذ العينات 302.
عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث. احسب عامل Z لتحديد موثوقية المقايسة. تشير عوامل Z في النطاق من 0.5 إلى 1.0 إلى أن جودة الفحص ممتازة.
يتم استبعاد اللوحات ذات عوامل Z أقل من 0.5. من التحليل ، يتم إعادة اختبار المركبات التي تعدل إشارة الفلورسنت في وجود اثنين من كلوريد الباريوم المليمولار أو 500 نانو تيرابين مولار Q لتأكيد خصوصية قناة البوتاسيوم للمعدل الداخلي الموضحة هنا هي إشارة فلورية تمثيلية HLB 0 2 1 1 15 2 تم قياسها بمرور الوقت في خلايا A TT 20 مع إضافة السوماتوستاتين أو محلول التحكم. تم حساب نسبة شدة الفلورسنت في المحور Y بقسمة الإشارة في وجود السوماتوستاتين أو محلول التحكم على إشارة خط الأساس المقاسة قبل إضافة السوماتوستاتين أو محلول التحكم.
يظهر هنا علاج خلايا A TT 20 مع 500 أضراس نانو. يمنع تيرابين Q الانخفاض بوساطة السوماتوستاتين في إشارة الفلورسنت عن طريق ربط اثنين وحجب قنوات G. ويظهر هنا علاج خلايا A TT 20 ب 20 ميكرومولار بروبافينون ، والذي يثبط أيضا الانخفاض بوساطة السوماتوستاتين في إشارة الفلورسنت بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على الأدوية التي تعدل قنوات grk باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إجراء فحص في الوقت الحقيقي لتحديد الأدوية التي تتفاعل مع قنوات البوتاسيوم المعدلة للداخل والمنظمة ببروتين G (GIRK). يستخدم هذا الاختبار صبغات فلورية حساسة للجهد الغشائي لقياس نشاط قنوات GIRK، مما يجعله قابلاً للتطبيق على مختلف الخطوط الخلوية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأدوية
- علم الأعصاب
- علم الفسيولوجيا الكهربائية
خلفية علمية
- تلعب قنوات GIRK دوراً حاسماً في الإشارات العصبية.
- يمكن أن يؤدي تحديد مُعدِّلات قنوات GIRK إلى استراتيجيات علاجية جديدة.
- تعزز المقاييس في الوقت الفعلي من كفاءة فحص الأدوية.
- توفر الأصباغ الفلورية مقياساً حساساً لنشاط القنوات.
الغرض من الدراسة
- تطوير إجراء لفحص الأدوية التي تعمل على تعديل قنوات GIRK.
- استخدام تنسيق عالي الإنتاجية لاختبار مركبات متعددة.
- تحسين فهم علم pharmacology لقنوات GIRK.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا TT 20 في لوح بـ 96 بئراً.
- استخدام نظام Verset لمناولة السوائل لتخفيف المركبات المختبرة.
- إضافة المركبات المخففة إلى الخلايا باستخدام نظام Verset.
- استخدام قارئ الألواح الفلوري Synergy two لقياس الاستجابات.
النتائج الرئيسية
- تحديد المركبات التي تغير الإشارات الناجمة عن السوماتوستاتين.
- إثبات قدرة المقايسة على التكيف مع خطوط خلوية متنوعة.
- التعديل الناجح لنشاط قنوات GIRK بواسطة المركبات المختبرة.
- التحقق من فعالية قارئ الأطباق الفلوري في عملية الفرز.
الاستنتاجات
- يعد هذا الاختبار المطور أداة قيمة لاكتشاف الأدوية التي تستهدف قنوات GIRK.
- يمكن للفحص في الوقت الفعلي أن يسّرع من عملية تحديد العلاجات المحتملة.
- هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاستكشاف الآثار السريرية للمركبات المحددة.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا المقايسة تحديد معدلات قنوات GIRK بإنتاجية عالية، مما يدعم التحقق من الأهداف في علوم الأعصاب واكتشاف أدوية القلب والأوعية الدموية. ومن خلال توفير قراءات فلورية كمية في الوقت الفعلي، فإنها تقلل الاعتماد على الفيزيولوجيا الكهربائية ذات الإنتاجية المنخفضة وتسرع عملية الانتقال من المركبات الواعدة إلى المركبات الرائدة. تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال ربط تأثيرات المركبات بالنشاط الوظيفي للقنوات في سياق خلوي ذي صلة فيزيولوجياً.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية عن طريق قياس التعديل الوظيفي لقنوات GIRK استجابةً لرتبطات GPCR.
- القيمة التشغيلية: تتيح الفحص السريع لمكتبات المركبات لتحديد المنشطات أو المثبطات ذات النوعية الميكانيكية.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر المتعلقة بالهدف من خلال تأكيد النشاط الموجه نحو الهدف عبر تغيرات إشارة الفلورة المرتبطة بتدفق K+.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تستخدم صبغات حساسة لجهد الغشاء (DiBAC4(3) أو HLB 021-152) لتوليد إشارات قابلة للقياس الكمي في الوقت الفعلي عند تنشيط GIRK.
- قابلية التكرار: يضمن حساب معامل Z-factor (النطاق الممتاز: 0.5–1.0) متانة المقايسة لاختيار المركبات الفعالة وتكرار الحملات البحثية.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع تنسيق الأطباق ذات الـ 96 بئراً وأنظمة مناولة السوائل (مثل Verset) للتوزيع الآلي للمركبات والفحص عالي الإنتاجية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: قد تساهم الموديلات المحددة في توجيه الاستراتيجيات العلاجية للألم الاعتلالي العصبي، والإدمان، واضطرابات نظم القلب عبر التثبيط العصبي بوساطة قنوات GIRK.
- الاستمرارية الانتقالية: توفر القراءات الفلورية جسراً يربط بين الارتباط بالهدف والمخرجات الوظيفية، مما يدعم تثبيت النمط الظاهري في الدراسات قبل السريرية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تم تأكيد النوعية باستخدام مثبطات مثل barium chloride أو Terapin Q للتمييز بين التأثيرات التي تتوسطها قنوات GIRK والنشاط خارج الهدف.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتناسب هذا الاختبار ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يتيح الفرز الوظيفي لمعدّلات GIRK قبل مرحلة التحسين اللاحقة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال ربط تنشيط GPCR بالتغيرات في الفلورة المعتمدة على GIRK، مما يوضح تعديل المسار.
- الفحص: يوفر جاهزية المقايسة من خلال تحميل الصبغة الموحد، وتطبيق المركبات، وقياس الفلورة الحركية على مدار 300 ثانية.
- التحليلات: يولد قياسات كمية للمتغيرات التابعة (نسب كثافة الفلورة) مما يتيح مقارنة قوة المركبات وفعاليتها.
- الأبحاث الانتقالية: يتصل بالعمل قبل السريري من خلال تحديد المركبات التي تغير الاستثارة العصبية عبر GIRK، وهو أمر ذو صلة بنماذج الألم والإدمان.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: منصة قابلة للتكيف عبر الخطوط الخلوية وربيطات GPCR، مما يعزز إعادة الاستخدام عبر حملات متعددة للتحقق من الأهداف.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في تعديل الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في فحص عقاقير القنوات الأيونية.
- القيمة التشغيلية: توفر التقييس، وقابلية التكرار، وبيانات حركية في الوقت الفعلي لا يمكن الحصول عليها من خلال المقايسات النهائية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو التوقف من خلال تمكين التحقق الوظيفي المبكر، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة بسبب نقص الارتباط بالهدف.
- التأثير على المحفظة: تسهل تحديد أولويات المركبات ذات نشاط GIRK المؤكد وفقاً للمخاطر المعدلة، تمهيداً للانتقال إلى مرحلة تحسين المركب الرائد.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا (خلايا AT T20)، والتعامل مع الأصباغ الفلورية، وتشغيل قارئ الأطباق الحركي.
- يعتمد على قارئ أطباق فلوري مزود بخاصية الحقن (مثل Synergy 2) وإعدادات إثارة/انبعاث متوافقة (520 nm/560 nm).
- يستلزم توحيد معايير تحميل الصبغة، وأوقات الحضن، وظروف المحلول المنظم عبر الآبار والأطباق.
- يتطلب التكييف مع خطوط خلوية أخرى التحقق من تعبير GIRK وكفاءة تحميل الصبغة.
- قيد عملي: يجب تأكيد خصوصية المقايسة باستخدام مثبطات متعامدة (مثل Ba2+، Terapin Q) لاستبعاد التغيرات الفلورية غير المرتبطة بـ GIRK.
