طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

الهدف من هذا الفيديو هو توضيح طريقة عزل وتحديد الحمض النووي الريبي ومكونات البروتين لمجمعات البروتين النووي الريبي من مستخلصات الخلايا باستخدام طرق الترسيب المناعي. مرحبا ، اسمي غاريت دوم وأنا طالب دراسات عليا في قسم علم الأحياء الجزيئية والميكروبية والمناعة في جامعة ميسوري أدرس تحت إشراف الدكتور إيلي سو. من التقدم في تسلسل الإنتاجية العالية والتحليل الفعال للمصفوفات الدقيقة ، أصبح التعبير الجيني العالمي وتحليله شكلا سهلا ومتاحا لجمع البيانات في العديد من البحوث ونماذج الأمراض.

ومع ذلك ، فإن مستويات حالة الدراسة للجين المستهدف mRNA لا ترتبط دائما ارتباطا مباشرا بمستويات بروتين الحالة المستقرة. يعد تنظيم الجينات بعد النسخ تفسيرا محتملا للاختلاف بين الاثنين. مدفوعة بتفاعلات بروتينات ربط الحمض النووي الريبي.

يؤثر تنظيم ما بعد النسخ على توطين mRNA واستقراره وترجمته عن طريق تكوين مركب بروتين نووي الضلع مع mRNAs المستهدفة. يعد تحديد أهداف Denovo mRNA غير المعروفة من المستخلصات الخلوية في هذا المركب أمرا محوريا لفهم آليات ووظائف بروتين ربط الحمض النووي الريبي وتأثيرها الناتج على إنتاج البروتين. يحدد هذا البروتوكول طريقة تسمى بروتين الريبو أو الترسيب المناعي المناعي أو RIP ، والتي تسمح بتحديد mRNAs محددة مرتبطة بمركب البروتين النووي الريبي.

قبل البدء في التجربة ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك جميع الكواشف والحاويات والأواني. تعالج الأواني الزجاجية الخالية من الحمض النووي الريبي باستخدام مثبط R nase مثل RNA ZAP من ambion ، متبوعا بالشطف بالماء المعالج dpci ، وتأكد من تأكيد جميع الكواشف على أنها خالية من الحمض النووي الريبي. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في حصاد مركب بروتين النوى الضلعي من خلايا الأنسجة التي تنمو محللة الخلوية بشكل كبير لإنتاج ما بين ملليغرامين إلى خمسة ملليغرامات من البروتين الكلي لكل عينة مستخدمة ، وعادة ما يكون طبقان من أطباق P one 50 كافيين.

نحن هنا نحصد MB 2 و 31 و MC سبعة خطوط خلايا لسرطان الثدي البشري ونحقق في تفاعلات نوى الريبون لبروتين ربط الحمض النووي الريبي. من هم من المهم ملاحظة أنه لكل بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبي يتم فحصه ، يجب تحسين العدد الخلوي الإجمالي وكميات البروتين لتعظيم تفاعلات بروتين ربط mRNA و RNA المستهدفة المناسبة. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثماني إلى 10 دقائق تقريبا عند أربع درجات مئوية ، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS البارد بعد الغسيل النهائي ، قم بنقر الجزء السفلي من الأنبوب برفق وأعد تعليق حبيبات الخلية بكميات متساوية من المخزن المؤقت للتحلل متعدد السومال المحضر مع الحمض النووي الريبي ومثبطات البروتياز.

يوصى بقياس الحجم الدقيق لخليط ماصة حبيبات الخلية برفق لتفكيك كتل الخلايا واحتضان المحللة على الجليد لمدة خمس دقائق. جهاز الطرد المركزي عند 13 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة المحللة من الحطام ، ونقل المادة الطافية التي تم تطهيرها على الفور إلى الحمض النووي الريبي المبرد مسبقا. تحافظ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المجانية على الثلج وتخزن عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

يمكن تخزين هذا المحلل لمدة تصل إلى ستة أشهر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تجنب دورات ذوبان الجليد المتكررة لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى تدهور البروتين أو الرنا المرسال. من الأفضل القيام بعنوان IP على الفور.

قم بقياس تركيز البروتين والمحللة بسرعة باستخدام مقايسة بروتين برادفورد القياسية. بعد ذلك ، سنحتاج إلى إعداد المواد لعزل البروتين الخاص بنا الذي تهمنا. أول بروتين منتفخ مسبقا.

حبات Sphero بين عشية وضحاها في N NT اثنين من المخزن المؤقت مكمل بمخزن BSA بنسبة 5٪ عند أربع درجات مئوية. استخدم المخزن المؤقت NT two بنسبة أربعة إلى واحد مع حبات PAS. من الممكن التخزين طويل الأجل لمدة تصل إلى عدة أشهر عند أربع درجات مئوية.

عند استكمالها ب 0.1٪ azi الصوديوم قبل الاستخدام ، قم بإزالة المخزن المؤقت NT Two الزائد بحيث تكون نسبة الخرزات النهائية إلى المخزن المؤقت واحدة إلى واحد. باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من الحمض النووي الريبي سعة 1.5 مليلتر ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من ملاط سرعة SRO وأضف 30 ميكروغراما من الجسم المضاد لكل تفاعل IP فردي. على سبيل المثال ، في تجربتنا نستخدم الجسم المضاد ، وهو جسم مضاد IgG للفأر.

لذلك فإن الجسم المضاد للتحكم لدينا هو أيضا IgG واحد. بعد ذلك ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من NT اثنين من المخزن المؤقت إلى مزيج حبة الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام الجسم المضاد المتطابق مع النمط المتطابق أو المصل الطبيعي الكامل من نفس النوع بالتوازي كتحكم في الجسم المضاد ضد الحمض النووي الريبي في الخلفية.

أضف الجسم المضاد المناسب إلى مزيج الخرز واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد الخرز المطلي بالأجسام المضادة مباشرة قبل الاستخدام عن طريق الغسيل بملليلتر واحد من الثلج البارد NT اثنين من العازلة خمس مرات غسل الخرز بالطرد المركزي عند 13 ، 000 جم لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند أربع درجات. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة يدوية أو شفاطة.

يساعد هذا الغسيل على إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة وكذلك ملوثات الحمض النووي الريبي من خليط الأجسام المضادة. بمجرد اكتمال الغسيل النهائي ، قم بتعليق الخرزات و 700 ميكرولتر من المثلج البارد T اثنين من المخزن المؤقت ، متبوعا بالمعالجة بمثبطات مختلفة من الحمض النووي الريبي لحماية mRNAs المستهدفة ، بما في ذلك 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، و 10 ميكرولتر من 100 ملليمولار DTT و 15 ميكرولتر من EDTA. ارفع الحجم إلى 900 ميكرولتر مع NT اثنين من المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، سنقوم بتسريع المركب المستهدف المناعي. نوصي بشدة باستخدام خطوة مسبقة الوضوح لتقليل إشارة الخلفية في تحليل الحمض النووي الريبي الخاص بك بعد إجراء التمزق قبل المسح مع 15 ميكروغراما من التحكم في النمط المتماثل لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أضف 50 ميكرولترا من حبات PAS المنتفخة غير المطلية بالجسم المضاد.

احتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع الدوران وأكثر في جهاز الطرد المركزي عند 10,000 جم عند أربع درجات مئوية. اثنين من بيليه. احفظ سوبر ناتين ل IP.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المحللة المعزولة مع ما يقرب من ملليغرامين إلى خمسة ملليغرامات من البروتين إلى مزيج الأجسام المضادة المحضر. سيساعد تخفيف المحللة على تقليل أنبوب التفاف الخلفية والنموذج لضمان السقف الضيق واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات متدحرجة وأكثر في حبات الحبيبات التالية عند 5 ، 000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وحفظ السوبرنات للتحليل المحتمل عن طريق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر كما هو موضح سابقا. اغسل الخرز خمس مرات بملليلتر واحد من البرد المثلج و T اثنين من العازلة والطرد المركزي.

ثم قم بإزالة سوبر ناتين باستخدام ماصة يدوية أو شفاطة. يمكن استخدام طرق أكثر صرامة من أجل تقليل الخلفية عن طريق استكمال NT اثنين من المخزن المؤقت مع ديوكسي كوت الصوديوم أو البول أو SDS. احتفظ بالعينات على الجليد قدر الإمكان واعمل بسرعة لتقليل تدهور الرنا المرسال المستهدف.

أخيرا ، سنستخدم الحمض النووي وعلاجات البروتيناز K متبوعة بهطول الأمطار من الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي للبروتين النووي الريبون بعد غسل حبات المعلقة ب 100 ميكرولتر من N NT اثنين من المخزن المؤقت المكمل بخمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي الحر من الحمض النووي الأولي واحد. احتفظ بالعينات عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. أضف ملليلترا واحدا من N NT اثنين من المخزن المؤقت وقم بالدوران عند 5 ، 000 جم لمدة خمس دقائق.

تخلص من بروتين SUPERNAT Reese ، وحبيبات SROs و 100 ميكرولتر من NT ، واثنين من المخزن المؤقت مع خمسة ميكرولترات من البروتيناز K بمعدل 10 ملليغرام لكل مليلتر وميكرولتر واحد من 10٪ SDS ، واحتضان خليط الخرزة المعلقة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 55 درجة مئوية ، مع النقر برفق كل 10 دقائق. سيساعد البروتيناز K في إطلاق مكونات بروتين نواة الضلع. حبات بيليه.

أضف 5 ، 000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واجمع الاسم الفائق ، والذي يجب أن يكون حجمه حوالي 100 ميكرولتر. بعد حبتين ، أضف 200 ميكرولتر من جهاز طرد مركزي NT اثنين من العازلة عند 5 ، 000 جم لمدة دقيقتين. اجمع ما يقرب من 200 ميكرولتر من سوبر ناتين وتخلص من الخرز.

يمزج السوبر ناتين ويضاف 300 ميكرولتر من دوامة الفينول الحمضية ذات الطبقة السفلى. دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وسرعة جهاز الطرد المركزي القصوى في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. اجمع 250 ميكرولتر من الطبقة العليا.

كن حذرا جدا حتى لا تزعج الواجهة لأن ذلك سوف يلوث. تضيف عينة الحمض النووي الريبي 25 ميكرولترا من أسيتات الصوديوم عند درجة حموضة 5.2 625 ميكرولتر من الإيثانول المبرد و 100٪ والإيثانول وخمسة ميكرولترات من مزيج الجليكو الأزرق. يخزن جيدا طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بالإضافة إلى ذلك لضمان الاسترداد السليم للحمض النووي الريبي. ستؤدي إضافة الجليكو الأزرق إلى زيادة رؤية حبيبات الحمض النووي الريبي من خلال العمل كجزيء ناقل في اليوم التالي ، وخلط الأنابيب عن طريق قلب ثلاث إلى خمس مرات ، ثم الدوران عند 12،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة والتخلص من السوبر ناتين. أضف ملليلترا واحدا من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ إلى الحبيبات الزرقاء وخلطها عن طريق الانعكاس أو جهاز الطرد المركزي الدوامي.

عينة عند 12,000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. تخلص من جهاز الطرد المركزي عند 12,000 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة أي بقايا ، 70٪ من الإيثانول باستخدام ماصة وحبيبات جافة بالهواء.

أضف درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أعد الإنفاق في 20 إلى 40 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، والمياه الخالية من الحمض النووي. العينة جاهزة الآن للقياس الكمي عن طريق قياس الطيف NanoDrop والمزيد من التطبيقات النهائية مثل PCR الكمي في الوقت الفعلي أو تحليل المصفوفات الدقيقة بعد عزل الحمض النووي الريبي ، والمصفوفة الدقيقة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي للكشف عن أهداف mRNA لبروتين ربط الحمض النووي الريبي ، وإثرائها الناتج عن الترسيب المناعي.

يكشف التأكيد عن اللطخة الغربية عن عزلة نظيفة لمن هم البروتين. يوضح تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي إثراء أضعاف الأكتين بيتا المستهدف mRNA مقارنة بعناصر التحكم IgG one. بينما يكشف تحليل المصفوفات الدقيقة عن ملامح جينية فريدة بين MC seven و MB 2 31 ، فقد تم إنشاء الترسيب المناعي للبروتين النووي الضلعي بشكل عام كأداة ممتازة تستخدم لعزل ودراسة التفاعلات بين بروتينات ربط الحمض النووي الريبي والتصوير بالرنين المغناطيسي. أهداف مجموعتنا ، بالإضافة إلى العديد من المجموعات البحثية الأخرى ، على الرغم من حساسيتها في طبيعتها وممارسة ، فإن التنفيذ السليم لهذا الإجراء سيؤدي إلى عزل مجمعات البروتين النووي الضلعية هذه ، والتي لم يكن من الممكن الوصول إليها حتى وقت قريب لاكتشافها وتحليلها.