فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تأثير معدلات النمط الظاهري مثل إسكات الجينات المضيفة أو تأثير الجزيئات الصغيرة على المتفطرة السلية ، والتكاثر داخل الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق الاستغناء أولا عن جزيئات صغيرة و 384 لوحة بئر أو نقل الخلايا مع irna و transfect إلى معقد. الخطوة التالية هي إصابة الخلايا ببروتين الفلورسنت الأخضر الذي يعبر عن المتفطرة السلية أو G-F-P-M-T-B إضافة خلايا إلى الجزيء الصغير الذي يحتوي على الآبار واحتضان الصفيحة الدقيقة لمدة خمسة أيام.

بالنسبة لنهج RNAi ، أضف الخلايا إلى مركب RNAi transfect الذي يحتوي على آبار. احتضان الصفيحة الدقيقة لمدة ثلاثة أيام ثم تصيب الخلايا ب G-F-P-M-T-B التي تعبر عن المتفطرة السلية. بعد تلطيخ الخلايا ، فإن الخطوة الأخيرة هي قراءة اللوحات باستخدام مجهر متحد البؤر الآلي.

في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري الآلي متبوعا بالتحليل المستند إلى الصور لقياس التغيرات في النمو داخل الخلايا G-F-P-M-T-V. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطريقة الحالية مثل تشكيل مستعمرة الصيد الأحادي هي أنها توفر فترة حضانة طويلة وتسمح بمزيد من الإنتاجية. سيتم إثبات هذا الإجراء كريستوف كيفال أو سونغ وثلاثة زملاء ما بعد الدكتوراه من فريق البحث الخاص بي.

تستخدم بروتوكولات فحص مكتبة الحمض النووي الريبي SI وفحص مكتبة المركبات GFP عمره أسبوعان يعبر عن مزارع المتفطرة السلية H 37 RV. لتحضير التعليق البكتيري G-F-P-M-T-B أولا الطرد المركزي الثقافة في 4,000 [غس] لمدة خمس دقائق, تجاهل المواد طافية [ريسوس], يعلق الثقافة داخل [دبس] وطرد مركزي ثانية في هذا طريقة. اغسل المزرعة ثلاث مرات باستخدام DPBS.

بعد الغسيل الثالث ، تخلص من supernat وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 10 مل من 10٪ FBS تحتوي على وسط RPMI 1640. اترك المعلق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح للمجاميع البكتيرية بالترسيب. اجمع السوبر البكتيري وقم بقياس OD عند 600 نانومتر ومضان GFP.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة لتحديد تركيز البكتيريا ، يجب أن يكون OD عند 600 نانومتر بين 0.6 و 0.8. احسب عيار التعليق باستخدام خط انحدار مرجعي ، مع عرض قيمة RFU كدالة لقيمة CFU التي تم إنشاؤها قبل التجارب على ثقافة أخرى تم إعدادها في نفس الظروف. التركيز النموذجي هو واحد في 10 إلى ثمانية بكتيريا لكل مليلتر.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق تعليق Resus لمكتبة الحمض النووي الريبي SI المجففة المخزنة في 96. حسنا لوحات الأم مع مخزن مؤقت واحد X-S-I-R-N-A بتركيز اثنين من الضرس الصغير. انقل 10 ميكرولترات من الخليط إلى كل بئر من صفيحة ابنة 384 بئر ، وانقل 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي SI من كل بئر من لوحة الابنة إلى لوحة فحص 384 بئر إلى نفس لوحة الفحص.

أضف 2.5 ميكرولتر لكل من التحكم السلبي والإيجابي IRNA إلى الآبار الخاصة بهم. إذا لم يتم استخدام لوحة الابنة على الفور ، فقم بإغلاقها بختم من الألومنيوم القابل للنزع يمكن تخزين الصفيحة المختومة عند سالب 20 درجة مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل وربما تصل إلى سنتين إلى ثلاث سنوات حسب IRNA.

توصيات الشركة المصنعة للمكتبة. قم بإعداد كواشف التعدي عن طريق تخفيفها في X-D-P-B-S للحصول على محلول كاف لتوفير 0.1 ميكرولتر لكل منها. حسنا ، قم باحتضان محلول التعداء المخفف مسبقا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أضف 7.5 ميكرولتر من محلول التعداء المخفف إلى كل بئر من لوحة فحص البئر 384 واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر من لوحة الفحص عند 40 ميكرولترا من الخلايا الرئوية من النوع البشري ، A 5 4 9 خلايا معلقة في وسط RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪. الحفاظ على الخلايا لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تنقسم هذه الخلايا كل 24 ساعة ، وبالتالي توجد حوالي 12،000 خلية في كل بئر بعد ثلاثة أيام من التعداد.

بعد ثلاثة أيام من si. تعداء الحمض النووي الريبي ل 5 49 خلية يحضر معلق بكتيري MTBH 37 RV GFP. كما هو موضح سابقا.

التعليق سوفت احتويت 2.4 مرات 10 إلى الستة جراثيم لكل مليلتر, أي يماثل إلى تعدد التلوث من خمسة. قم بإزالة الوسط الموجود في لوحة فحص البئر 384 وأضف 25 ميكرولترا من المعلق البكتيري لكل بئر. احتضان صفيحة فحص البئر 384 عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد خمس ساعات. قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام وسيط RPMI المكمل بنسبة 10٪ FBS لقتل البكتيريا خارج الخلية المتبقية. عالج الخلايا في كل بئر ب 50 ميكرولتر.

وسيط R-P-M-I-F-B-S طازج يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من أميكاسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أخيرا ، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على Amikacin وأضف 50 ميكرولترا من وسط RPMI الطازج المكمل بنسبة 10٪ FBS لكل منهما. حسنا.

احتضان لوحة الفحص عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل الفحص بواسطة المجهر متحد البؤر. لبدء هذا الإجراء ، قم بإذابة صفيحة أم 384 بئر تحتوي على مكتبة المركبات القابلة للذوبان في DMSO بنسبة 100٪ عند نقل درجة حرارة الغرفة 0.5 ميكرولتر من المركبات من الصفيحة الأم إلى صفيحة ابنة 384 بئر تحتوي على 10 ميكرولتر لكل بئر من RPMI 1640. متوسط مكمل بنسبة 10٪ FPS في الحصاد التالي للبلاعم البشرية الأولية البالغة من العمر ستة أيام في أربعة أضعاف 10 إلى خمس خلايا لكل مليلتر في RPMI 1640.

متوسط مكمل ب 10٪ FPS و 50 نانوجرام لكل ملليلتر. يحتضن MCSF البشري المؤتلف الخلايا الأولية المخففة مع قاعدية في MOIs مختلفة تتراوح من واحد إلى خمسة في التعليق مع اهتزاز خفيف عند 90 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلايا المصابة بالطرد المركزي عند 350 GS لمدة خمس دقائق لإزالة البكتيريا خارج الخلية.

Resus بتعليق الكريات في RPMI 1640. متوسط مكمل بنسبة 10٪ FPS وجهاز طرد مركزي. مرة أخرى ، كرر هذا ، اغسل مرتين بعد الغسيل النهائي.

يعلق Resus الخلايا المصابة في وسط RPMI 1640 المكمل بنسبة 10٪ FBS و 50 ميكروغرام لكل مليلتر. يحتضن Amikacin التعليق مع اهتزاز خفيف لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية جهاز طرد مركزي عند 350 GS لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على أميكاسين واغسل الخلايا المصابة باستخدام RPMI 1640 الكامل.

متوسط مكمل بنسبة 10٪ FBS و 50 نانوجرام لكل ملليلتر. MCSF البشري المؤتلف. كرر هذا الغسيل مرة واحدة.

أضف 40 ميكرولترا لكل بئر من تعليق البلاعم المصاب إلى نفس لوحة فحص البئر 384 المعدة مسبقا ، والتي تحتوي بالفعل على 10 ميكرولتر من تخفيفات المركب. التركيز النهائي ل DMSO في كل بئر هو الآن 1٪ احتضان لوحات الفحص لمدة خمسة أيام عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل الفحص بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر لمكتبة SI RNA. عند الفحص قبل الحصول على الصورة ، أضف إلى كل بئر من لوحة الفحص 10 ميكرولتر من 30 ميكروغراما لكل مليلتر DPI محضر حديثا في PBS واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.

للفحص المركب قبل الحصول على الصورة ، قم بتلطيخ الخلايا الحية بصبغة فلورسنت حمراء بعيدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بتحميل لوحات الفحص في مجهر متحد البؤر الآلي. اضبط معلمات التعريض الضوئي لتسجيل مضان DPI باستخدام ليزر الإثارة عند 405 نانومتر مع مرشح انبعاث عند 450 نانومتر.

سجل مضان GFP باستخدام ليزر الإثارة عند 488 نانومتر مع مرشح انبعاث عند 520 نانومتر. حدد الآبار والحقول في كل بئر ليتم الحصول عليها ، والتي يشار إليها بعد ذلك باسم التخطيطات والتخطيطات الفرعية. تقوم المعلمات بإنشاء ملف التجارب باستخدام المعلمات المحددة وتشغيل الاستحواذ التلقائي.

في هذه الحالة ، يتم تسجيل أربع صور مختلفة لنفس البئر والحقل لنقل الصور إلى خادم بعيد. بعد ذلك يتم تقييم الصور باستخدام برنامج تحليل الصور acapella 2.6 لفحص الحمض النووي الريبي SI. يحتوي كل حقل على قناتين أو لونين.

أخضر للبكتيريا والأزرق للخلية. تكتشف النوى نوى الخلية من قناة DAPI باستخدام خوارزمية الكشف عن النوى والمنطقة البكتيرية من قناة GFP باستخدام خوارزمية خصائص شدة البكسل. من خلال دمج القنوات وحساب عدد وحدات البكسل المشتركة بين كل من البكتيريا والخلايا ، يتم قياس البكتيريا داخل الخلايا.

النتائج النهائية التي يتم التعبير عنها كمتوسط للحقول الأربعة هي إجمالي مساحة البكتيريا ، والعدد الإجمالي للخلايا ، والنسبة المئوية للخلايا المصابة ، والمنطقة البكتيرية لكل خلية. بالنسبة للفحص المركب ، يحتوي كل حقل على قناتين أو لونين ، أخضر للبكتيريا وأحمر بعيد للخلية. تكتشف النوى والسيتوبلازم منطقة الخلية من القناة الحمراء البعيدة والمنطقة البكتيرية من قناة GFP باستخدام خوارزمية خصائص شدة البكسل.

من خلال دمج القنوات وحساب عدد وحدات البكسل التي تشترك فيها كل من البكتيريا والنوى ، يتم قياس البكتيريا داخل الخلايا. النتائج النهائية التي يتم التعبير عنها كمتوسط للحقول الأربعة هي المساحة البكتيرية الإجمالية ، والمساحة الخلوية الكلية ، والمساحة الإجمالية للبكتيريا داخل الخلايا ، والنسبة بين المنطقة البكتيرية داخل الخلايا والمساحة الإجمالية للخلايا. يتم تقديم النتائج التمثيلية لفحص الحمض النووي الريبي SI عالي الإنتاجية على مستوى الجينوم هنا ، مما أدى إسكات التعبير عن din one مع SI RNA إلى انخفاض كمية البكتيريا الفطرية داخل الخلايا في 5 49 خلية.

كما هو موضح في هذه الصور متحدة البؤر التمثيلية ل 5 49 خلية منقولة ب IRNA غير المستهدف أو مع SI RNA خاص ب din one والمصابة ب GFP التي تعبر عن MTB لمدة خمسة أيام. تم تصور GFP MT BH 37 RV باللون الأخضر والخلايا باللون الأحمر. تم تحديد عدد الخلايا وحمل G-F-P-M-T-B-H 37 RV داخل الخلايا باستخدام برنامج التحليل المستند إلى الصور.

يوضح هذا الرسم البياني النسبة المئوية للإصابة ب 5 49 خلية في خمس نسخ مكررة من الإيرنا المتدافع ممثلة بالدوائر الزرقاء و din one irna ممثلة بالدوائر الحمراء. بعد ثلاثة أيام من الإسكات وخمسة أيام من العدوى ، تنخفض النسبة المئوية للخلايا المصابة بمقدار النصف في ضجيج واحد تم إسكات 5 49 خلية مقارنة بالخلايا التي تم نقلها باستخدام IRNA غير المستهدف. تم تطبيق التطبيع القائم على العينة من SI RNA المستهدف DIN واحد مقارنة بالتدافع لتحديد درجة Z.

تم الحصول على متوسط درجة Z حوالي سالب 15 ل SI ، وهو DIN مستهدف. تمثل العلامات النجمية الثلاث قيمة P أقل من 0.0001. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام DIN one كعنصر تحكم إيجابي في si ، وهي شاشة لاكتشاف عوامل مضيفة جديدة أخرى تشارك في استعمار MTB والخلايا الرئوية التي يمكن أن يكون لها نفس النمط الظاهري مثل dins IRNA في الفحص المركب عالي المحتويات.

تم تقييم الكفاءة المركبة على نمو البكتيريا داخل الخلايا من خلال إنشاء منحنى استجابة الجرعة أو DRC والتطبيع إلى المركبات الإيجابية والسلبية المرجعية. في هذا المثال ، تم احتضان البلاعم الأولية البشرية المصابة ب GFP الذي يعبر عن سلالة MTBH 37 RV مع 1٪ DMSO كعنصر تحكم سلبي أو بتركيزات متزايدة من مركبين مرجعيين ، isid و INH و rifampicin. الريف. تم تصنيف البلاعم بصبغة مضان حمراء ويشير اللون الأخضر إلى أن تحليل MTB لصور التألق متحد البؤر للبلاعم البشرية المصابة كشف أن المركبات النشطة تؤثر على التكاثر داخل الخلايا ل MTB في الخلايا المضيفة مما يؤدي إلى انخفاض الحمل الفطري ، والذي يتوافق مع منطقة إشارة GFP في الخلايا.

تم حساب النسبة بين المساحة البكتيرية داخل الخلايا ومساحة الخلية الإجمالية ثم رسمها كدالة لتركيز المركبات لتوليد جمهورية الكونغو الديمقراطية الموضحة هنا هي DRCs من isid و rifampicin في كل رسم بياني. تم تطبيع جمهورية الكونغو الديمقراطية للمركب إلى أن 1٪ DMSO ، والتحكم السلبي و 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر من التحكم الإيجابي. تسمح هذه المنحنيات بتحديد كل من التركيز المطلوب لتثبيط 50٪ من الاستعمار البكتيري والحد الأدنى من التركيز المطلوب لتثبيط 99٪ من التكاثر البكتيري في فصل دراسي واحد.

هذا ، يمكن إجراء هذه التقنية في 10 ساعات مقسمة على النحو التالي ، ساعتان لتعداء الخلايا أو التحضير المركب ، وست ساعات لعدوى الخلايا والاستغناء عنها في صفيحة دقيقة وساعتين للحفاظ على الحصول على الصورة. هذا على مدى ثمانية أيام ، لا تنس أن العمل مع المتفطرة السلية يمكن أن يكون للغاية كفنانين وأن النضج المبكر ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك القناع ، يجب دائما أن يؤخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.