توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء نماذج تنبؤية للتعبير العابر عن البروتينات في أوراق النبات. يتم تحقيق ذلك من خلال إعداد تصميم تجريبي لتحديد أهم المعلمات للتعبير العابر وتحديد تأثيرها على تراكم البروتين. كخطوة ثانية ، يتم استنساخ الجينات ونقلها إلى بكتيريا زراعية ، والتي يتم حقنها بعد ذلك في الأوراق مما يؤدي إلى تعبير البروتين العابر.

يتم تحليل عينات الأوراق التالية من أجل تحديد مستويات التعبير عن البروتين. تم الحصول على النتائج التي توضح نمط مستويات التعبير عن البروتين العابر في الأوراق من مختلف الأعمار ولظروف الحضانة المختلفة بناء على تصميم تقييم نموذج التجربة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل عامل واحد في كل مرة ، هي أنه يمكن اكتشاف التفاعلات بين المعلمات المختلفة مثل عمر الإجازة أو الورقة الموضعية وتحديدها كميا.

العامل الوحيد في كل مرة الذي يستخدم غالبا لتوصيف تأثير عوامل معينة على نتيجة التجربة هو دون المستوى الأمثل لأن الركض الفردي أثناء التجربة سيتم محاذاته مثل اللؤلؤ على خيط ، وبالتالي تحقيق تغطية منخفضة لمساحة التصميم. على النقيض من تصميم تجارب استراتيجية وزارة الطاقة ، فإن الاختلاف في أكثر من عامل واحد في وقت واحد يعزز التغطية وبالتالي دقة النماذج الناتجة. علاوة على ذلك ، فإن تغطية مساحة التصميم المتحيزة في عامل واحد في كل مرة.

يمكن أن تفشل التجارب أيضا في تحديد مناطق التشغيل المثلى والتنبؤ بالحلول دون المستوى الأمثل ، في حين أن استراتيجيات وزارة الطاقة من المرجح أن تحدد الظروف المفضلة. يوضح هذا المخطط الانسيابي عملية تخطيط استراتيجية وزارة الطاقة. تتمثل الخطوة الأولى في تحديد العوامل والاستجابات ذات الصلة لإدراجها في التصميم.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم قياس مستويات التعبير عن نموذج الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لفيروس نقص المناعة البشرية G 12 ، وعلامة الفلورسنت ، والبروتين DS الأحمر بناء على التجارب السابقة. سيكون الحد الأدنى للفرق الذي يمكن اكتشافه يعتبر ذا صلة هو 10 ميكروغرام لكل مليلتر لاثنين من G 12 و 20 ميكروغرام لكل مليلتر ل DS red. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون القيم التقريبية للانحراف المعياري المقدر للنظام لاثنين من G 12 و DS red أربعة وثمانية ميكروغرامات لكل مليلتر على التوالي.

لن تتم مناقشة الخطوات المتبقية لتخطيط استراتيجية وزارة الطاقة هذه هنا ، ولكن يمكن العثور على التفاصيل في المخطوطة المصاحبة. سيتم التعبير عن اثنين من G 12 و DS الأحمر بشكل عابر في نباتات التبغ. لبدء إجراء زراعة النباتات ، قم بإعداد كتل الجدران الصخرية 10 × 10 × ثمانية سنتيمترات عن طريق وميضها على نطاق واسع بالماء منزوع الأيونات لإزالة المواد الكيميائية المتبقية.

بعد ذلك ، قم بموازنة الكتل بمحلول معد حديثا من نباتات تبغ بذور الأسمدة عن طريق وضع بذرة أو بذرتين من بذور التبغ على كل كتلة جدار صخري ، متبوعا بتدفق قصير بالأسمدة. احرص على تجنب غسل البذور وإنبات نباتات التبغ وزراعتها لمدة 42 يوما في دفيئة في ظل ظروف مناسبة. قم بإعداد AUM FASS عن طريق تنمية ثقافة إلى OD 600 نانومتر من 5.0.

تمييع المزرعة بالماء ووسيط التسلل المزدوج لتتناسب مع OD 600 نانومتر المطلوب للحقن قبل الحقن. تأكد من OD 600 نانومتر من الغلاف الجوي لتعليق fasion لتحضير الأوراق للحقن. قم بخدش البشرة برفق في موقع الحقن باستخدام طرف ماصة لتسهيل تدفق محلول AUM Fasion.

تجنب تمزق نصل الورقة أثناء القيام بذلك. أمسك المحقنة التي تحتوي على تعليق AUM fasion بشكل عمودي على شفرة الورقة ، ولمس البرميل مقابل الحقل الوربي المراد معالجته ، وادفع المخرج برفق إلى الجانب السفلي من الورقة. في الوقت نفسه ، اضغط على الجانب العلوي من الورقة برفق لمنع شفرة الورقة من التحول أو التمزق.

ادفع مكبس المحقنة برفق لأسفل. سيدخل حل أزياء AUM إلى الفراغات بين الخلايا داخل شفرة الورقة كما هو موضح في المناطق المعالجة التي تظهر أغمق وخضراء ورطبة. تأكد من بقاء المحقنة عموديا على الورقة أثناء الحقن.

خلاف ذلك ، قد ينفجر التعليق البكتيري تحت ضغط عال. كرر هذا الإجراء في عدة مواضع حتى يتم اختراق المجال الوربي بالكامل مع aum و aum و fass. ثم استمر في الحقل الوربي التالي بعد الحقن ، واحتضان النباتات في ظل الظروف التي تحددها وزارة الطاقة عند اكتمال فترة الحضانة.

ابدأ أخذ العينات. قم بتثبيت الورقة بمنشفة ورقية محمولة باليد واستخدم مقترض الفلين لإزالة أربعة إلى خمسة أقراص ورقية من الحقول الوربية المعالجة في المواضع والأوقات التي حددتها وزارة الطاقة. لا تقم بإزالة الورقة بأكملها من النبات أثناء أخذ العينات.

حدد كتلة كل عينة وضعها في أنبوب تفاعل بلاستيكي سعة 1.5 ملليلتر مسمى باسم العينة والكتلة. قم بتخزين العينات عند سالب 20 درجة مئوية أو سالب 80 درجة مئوية قبل تحديد كمية البروتين. قد يتم إيقاف العملية مؤقتا في هذه المرحلة لعدة أشهر ، اعتمادا على استقرار العينة ودرجة حرارة التخزين لاستخراج البروتينات من عينات قرص الأوراق.

أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للاستخراج لكل ملليغرام من كتلة العينة وطحن أقراص الأوراق في أنبوب التفاعل باستخدام مدقة كهربائية حتى تختفي شظايا كبيرة. لتجنب ارتفاع درجة حرارة العينة ، ضع الأنبوب على الجليد كلما شعر الأنبوب بالدفء بعد الطرد المركزي. لإزالة المواد الصلبة المشتتة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب تفاعل نظيف 1.5 ملم.

قم بقياس التألق الأحمر DS مرتين بالتتابع. في قارئ 96 تم تشغيله بشكل جيد مزود بإثارة 530 25 نانومتر و 590 مرشح انبعاث 35 نانومتر لكل عينة. متوسط التألق على القراءتين والتكرارات التقنية الثلاثة واطرح القيمة المسجلة للتحكم الفارغ الذي يحتوي على صفر ميكروغرام لكل مليلتر DS أحمر.

اطرح أيضا هذه القيمة من قصب التخفيفات القياسية واستخدم هذه القيم المصححة الفارغة للانحدار الخطي الذي ينتج عنه منحنى مرجعي. ثم يتم استخدام ميل المنحنى المرجعي لتحويل التألق المقاس للعينات إلى تركيزات حمراء DS. لن يتم عرض إجراء تحديد تركيز الجسمين المضادين G 12 هنا ، ولكن تم تفصيله في المخطوطة المصاحبة.

يستخدم برنامج Design Expert لتحليل البيانات وتقييمها في عقدة التحليل. اختر الاستجابة المراد تحليلها وحدد في البداية لا شيء في علامة تبويب التحويل. تابع إلى علامة التبويب ملخص الملاءمة، التي توفر معلومات عامة حول العوامل المهمة للنظام قيد التحقيق.

سيقترح البرنامج نموذجا أوليا بناء على أهميته في علامة تبويب النموذج. يتم تحديد النموذج الأولي مسبقا بناء على نتائج ملخص الملاءمة. استخدم الوضع التلقائي لتحرير هذا النموذج في علامة التبويب Innova.

التحقيق في النموذج المقترح والعوامل المضمنة إذا لزم الأمر. قم بإزالة أي عوامل ذات قيم P أعلى من عتبة محددة مسبقا يدويا أو تلك غير المحتملة بناء على الاعتبار الميكانيكي عن طريق التبديل مرة أخرى إلى علامة تبويب النموذج ، وتغيير التحديد إلى يدوي وإزالة العوامل المناسبة من النموذج. تابع إلى علامة تبويب التشخيص لتأكيد جودة النموذج واكتشاف القيم المتطرفة المحتملة في مجموعة البيانات التي لها تأثير قوي على النموذج.

من خلال فحص جميع علامات التبويب في أداة التشخيص، اضبط نوع التحويل في علامة التبويب وفقا إذا اقترحه المربع رسم كوكس وأعد تشغيل إجراء التحليل في علامة تبويب الرسوم البيانية للنموذج. تصور النموذج الذي تم تقييمه لعدد محدود من العوامل الرقمية مثل ثلاثة. يعد تمثيل سطح الاستجابة مفيدا لتقييم الخصائص المثلى.

توضح أسطح الاستجابة اليدوية فقط تأثير عاملين على الاستجابة قيد التحقيق. يتم الكشف عن تأثير أي عامل إضافي على الاستجابة عن طريق تغيير قيمته أو مستواه في نافذة أداة العوامل. بدلا من ذلك ، يمكن تعيين العوامل لمحور المخطط عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن عليها في نافذة أداة العوامل وتحديد محور المتغير المستقل المطلوب.

قم بمعالجة مستويات العامل وتعيينها لإحداثيات الرسم البياني باستخدام أداة العوامل. قم بتصدير الرسوم البيانية باستخدام الأمر export graph to file في علامة تبويب file. استخدم العقدة الفرعية الرقمية في عقدة التحسين لتحسين الاستجابة المطلوبة عدديا، اعتمادا على عوامل النموذج التي يمكن بدورها تطبيق قيود معينة عليها عبر علامة تبويب المعايير.

احسب الحلول الرقمية وفحصها في علامة تبويب الحلول استنادا إلى الإدخال المقدم في علامة تبويب المعايير. قم بتصدير هذه الحلول إلى برامج أخرى مثل جدول بيانات لمزيد من التحليل للكشف عن إعدادات العامل المرتبطة بقيم الاستجابة العالية أو المنخفضة. يكون هذا مفيدا إذا تم التحقيق في أكثر من ثلاثة عوامل رقمية ، وكان التمثيل ثلاثي الأبعاد صعبا في هذه الدراسة التمثيلية.

استخدمت استراتيجية DOE لفحص تأثيرات المحفزات المختلفة وخمسة RS أولية على التعبير العابر ل ds. يتم عرض العوامل الحمراء المدرجة في نموذج التعبير العابر والنطاقات التي تم فحصها في هذا الجدول. العوامل الجريئة فريدة من نوعها لهذه التجربة.

العوامل الموجودة في الخط المائل هي لتجربة أخرى سيتم وصفها لاحقا. تم اختيار ثلاثة مستويات على الأقل لجميع العوامل الرقمية السرية للسماح بحساب نموذج قاعدة تربيعي. تم اختيار خوارزمية الاختيار الأمثل لاختيار عمليات تشغيل DOE للحصول على أدق التقديرات لمعاملات نموذج الانحدار.

يتكون التصميم الذي اقترحه خبير التصميم في البداية من 90 جولة ، لكن FDS لم يكن كافيا لتحقيق خطأ قياسي بنسبة 1٪ في التنبؤ. أدت الزيادة المثلى للتصميم إلى ما مجموعه 210 أشواط إلى حل هذه المشكلة وأسفرت عن FDS بنسبة 100٪ مع دقة تنبؤ أكثر اتساقا عبر مساحة التصميم المشار إليها بواسطة المنحنى المسطح ، وتم تحديد تركيزات DS الحمراء لجميع عمليات التشغيل البالغ عددها 210 وتم تحويل البيانات 10. تم اختيار عوامل النموذج عن طريق الاختيار الآلي للخلف من نموذج مكعب بمستوى ألفا 0.100.

نتج عن ذلك نموذج مهم مع نقص ضئيل في الملاءمة وقيم عالية لمعاملات الارتباط المتعددة. كانت قيمة P لجميع عوامل النموذج أقل من 0.05 ، وبالتالي لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من التلاعب اليدوي بالنموذج. احتوى النموذج على ثلاثة تفاعلات عاملة تم إبرازها بالخط العريض والتي لم تكن جزءا من إعادة تقييم النموذج الأساسي التربيعي الأولي للرسم البياني FDS.

كشف استخدام جميع العوامل المدرجة في نموذج التنبؤ النهائي أن FDS للخطأ المعياري للتنبؤ لم يتضاءل بشكل كبير من خلال تضمين التفاعلات الثلاثة الإضافية. أشارت أدوات تشخيص جودة النموذج في خبير التصميم إلى أن تحويل البيانات كان مفيدا ولم تكن هناك عوامل مفقودة في النموذج لأن المخطط الطبيعي للمخلفات أظهر سلوكا خطيا ولم يلاحظ نمط محدد في المخلفات مقابل المخطط المتوقع. لم يكن هناك أيضا اتجاه طوال فترة التجربة للإشارة إلى متغير مخفي يعتمد على الوقت.

بدلا من ذلك ، كانت تنبؤات النموذج متوافقة بشكل جيد جدا مع مضان دياز الأحمر المرصود حيث تقع جميع النقاط بالقرب من القطر. لذلك كان من المفترض أن النموذج المختار كان مفيدا للتنبؤ بالتعبير العابر ل DS red في أوراق التبغ غير الرصاصية المشتقة من محفز مختلف خمس مجموعات أولية UTR خلال فترة حضانة ما بعد التسلل التي استمرت ثمانية أيام ، كما تم اختيار نموذج الانحدار الخطي الاصطناعي بدون تحويل البيانات لتوضيح عواقب اختيار العوامل الخاطئة والتحويل. كما هو موضح بوضوح هنا ، فإن المخطط الطبيعي للمخلفات ينحرف عن السلوك الخطي المتوقع وهناك نمط على شكل حرف V في المخلفات مقابل المخطط المتوقع بدلا من التشتت العشوائي.

بالإضافة إلى ذلك ، تسلط المخلفات مقابل مخطط التشغيل الضوء على قيمتين متطرفتين. في حين أن التنبؤات كانت ضعيفة لكل من القيم الصغيرة والعالية المنحرفة عن القطر ، فإن أسطح استجابة النموذج المثلى للتعبير الأحمر العابر DS في أوراق التبغ موضحة هنا. تنبأ النموذج بأن عمر الأوراق كان عاملا مهما مع انخفاض مستويات التعبير في الأوراق القديمة ، على سبيل المثال ، الورقة الثانية في القطعة A والمؤامرة B مقارنة بالأوراق الصغيرة مثل الأوراق السادسة في القطعة C والمؤامرة D ، ولم يكن تطور تراكم DS الأحمر في الأوراق خطيا أو أسيا ، ولكنه اتبع منحنى سيني خلال الأيام الثمانية من حضانة التسلل.

أدت مجموعات UTR الخمس الرئيسية مع مروج CAMV 35 SS إلى تعبير أحمر DS أقوى من المجموعات مع مروج NOS. على الرغم من أن UTR الخمسة الأولية كان لها أيضا تأثير كبير على التعبير الصحيح ل DS كما هو موضح في المقارنة بين TL و CHS ، إلا أن قوة التعبير كانت تعتمد على المروج المصاحب. أشار النموذج التنبؤي أيضا إلى أن أزواج معينة من المروج ، وخمس مجموعات UTR رئيسية ، مثل nas ، CHS و CAMV ، 35 ، SS ، CHS ، أدت إلى مستويات تعبير متوازنة تختلف بأقل من 30٪ عن نسبة محددة عبر جميع الأوراق وأوقات الحضانة التي تزيد عن يومين.

سيكون هذا التعبير المتوازن مفيدا للتعبير عن البروتينات متعددة العضلات باستخدام قياس متكافئ محدد. كما استخدم نهج وزارة الطاقة لتحسين ظروف الحضانة ومخططات الحصاد للإنتاج المتزامن لاثنين من G 12 و DS الأحمر في التبغ. العوامل المؤثرة على التعبير العابر التي تم تضمينها في هذه التجربة هي بخط مائل OD 600 نانومتر ووقت الحضانة.

تم إنشاء نموذج تنبؤي للتعبير عن كل بروتين في النباتات في مختلف الأعمار. تم حصاد الأوراق الصغيرة في 40 يوما بعد بذر الأوراق القديمة في 47 يوما بعد البذر. ثم تم تقييم هذه النماذج الأربعة وإنشاء نموذج إجماع يتضمن كل عامل وجد أنه مهم في النماذج الفردية.

تم التأكيد لاحقا على أن نموذج الإجماع لا يزال يمثل تمثيلا جيدا لجميع مجموعات البيانات الأولية. تم استخدام نموذج الإجماع لاحقا لتحديد درجات حرارة الحضانة المثلى و OD البكتيري 600 نانومتر لكل من البروتينات للتنبؤ بتركيزات البروتين في جميع الأوراق ومواقع الأوراق في النباتات الصغيرة والكبيرة. ثم أدى دمج ملفات تعريف التركيز مع بيانات الكتلة الحيوية إلى إنتاجية مطلقة للبروتين.

ثم تم ربط كميات البروتين المطلقة بالتكاليف النهائية المرتبطة بها ، مما يسمح بتحليل التكلفة والفائدة لمعالجة كل ورقة لكل عمر للنبات. تم العثور على نفس الكمية من DS red وحوالي 65٪ من اثنين من G 12 في النباتات الصغيرة مقارنة بالنباتات القديمة ، على الرغم من انخفاض متوسط الكتلة الحيوية بنسبة 50٪ تقريبا مما يعكس التعبير النوعي الأعلى للبروتين في النباتات الصغيرة. كشف هذا أن النباتات الصغيرة كانت مفيدة للتعبير العابر لأن البروتينات وصلت إلى تركيزات أعلى خلال فترات نمو أقصر على الرغم من انخفاض الكتلة الحيوية الإجمالية مقارنة بالنباتات القديمة.

أخيرا ، وجد أيضا أن معالجة جميع الأوراق من النباتات القديمة كانت أغلى من التخلص من الأوراق من واحد إلى ثلاثة وزيادة عدد النباتات لكل دفعة بدلا من ذلك. ومن ثم ، فإن النماذج القائمة على وزارة الطاقة مناسبة ليس فقط لتحديد الخطوة الأخيرة من التجربة ، ولكن أيضا للجمع مع البيانات الأخرى لتسهيل الجوانب الأكثر تعقيدا لتحليل العملية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتحليل وزارة الطاقة للتحقيق في التعبير العابر للبروتين في النباتات.