الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد المواقع الدقيقة لناقلات الفيروسات المندمجة في الجينوم. ويتم تحقيق ذلك من خلال تفاعل PCR خطي أولي باستخدام بادئات مبيوتنة (biotinylated primers) لإثراء تسلسلات الوصلات بين الناقل والجينوم من الحمض النووي الجينومي على طور صلب في سلسلة من التفاعلات، حيث يتم توليد حمض نووي مزدوج السلسلة بتسلسلات DNA معروفة على كلا طرفي المنتج، مما يسمح بالتضخيم الأسي لوصلات جينوم الناقل. بعد ذلك، يتم دمج محولات التسلسل (sequencing adapters) في نواتج تفاعل PCR.

من أجل تسلسل وتوصيف الحمض النووي المجهول المتاخم باستخدام التسلسل العميق، تكشف هذه الشظايا عن المواقع الدقيقة لاندماجات الناقل. والنتيجة هي تنوع في الوصلات المضخمة كما تظهر من خلال الرحلان الكهربائي للهلام. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول توزيع مواقع اندماج الناقل الفيروسي لدى المرضى الذين يخضعون للعلاج الجيني السريري.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً في دراسات أخرى مثل الطفرات الإدخالية، والمسوحات الجينية، والعدوى الفيروسية، والسرطان، وتعدد النسائل في الخلايا الجذعية أو تنوع الخلايا التائية. سيقوم ina RA، وهو فني من مختبري، بشرح هذا الإجراء. لتحضير هذا الإجراء، ابدأ أولاً بتجهيز كاسيتات الرابط (linker cassettes) من خلال خلط 40 µL من كل من LCO Legos الاثنين مع 110 µL من tris hydrochloride، و 10 µL من magnesium chloride في أنبوب طرد مركزي دقيق. بعد ذلك، ضع الخليط في الحضانة على كتلة تسخين بدرجة حرارة 95 °C لمدة خمس دقائق، ثم اتركه يبرد ببطء حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في اليوم التالي، أضف 300 µL من الماء إلى الرابط المزدوج الخيوط (linker DNA) الذي تم تحضيره، ثم قم بترشيح الخليط باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق. قم بتدوير المرشح لجمع الحمض النووي الرابط المركز في الأنبوب. بعد ذلك، استعد الأنبوب من المرشح.

أضف 80 µL من الماء إلى المخرجات واستخدم الماصة. وزع كميات قدرها 10 µL في أنابيب PCR. استخدم تقنية PCR للتضخيم المسبق لوصلات جينوم الناقل في أنابيب تفاعل سعة 50 µL لـ lamb.

أضف ما بين 1 nanogram و 1 microgram من DNA العينة لكل تفاعل بحجم 50 µL. بالنسبة لـ NR lamb، استخدم 100 nanograms على الأقل من DNA. لا تضف أكثر من 25 µL، وقم بإجراء PCR وفقاً للجدول 2 في النص.

وعند الاكتمال، أضف 0.5 µL إضافية من التقنية إلى كل تفاعل وقم بتشغيل برنامج PCR للمرة الثانية. أولاً، قم بتحضير الحبيبات المغناطيسية؛ أضف 20 µL من الحبيبات المغناطيسية المغلفة بـ strept ENC إلى أنبوب سعة 1.5 mL وضعها على فاصل الحبيبات المغناطيسية لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، تخلص من الطافي. قم بتعليق الخرزات في 40 µL من PBS مع BSA وأعد الخرزات إلى الفاصل لمدة دقيقة أخرى. استبدل الطافي بغسلة بحجم 20 µL من محلول كلوريد الليثيوم بتركيز 3 M.

ومرة أخرى، ضع الخرزات على الفاصل لمدة دقيقة واحدة. وأنهِ العملية باستبدال الطافي بـ 50 µL من محلول كلوريد الليثيوم بتركيز 6 molar. الآن، أضف مزيج الخرزات المغناطيسية إلى ناتج تفاعل PCR واترك هذا المزيج ليتحضن لمدة تتراوح من ساعتين إلى ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف.

ستشكل الحمض النووي DNA المبيوتني والشرائط والخرز المغلف معقدات يمكن تخزينها عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى أربعة أيام. استكمل العمل باستخدام LAMP أو NR-LAMP. وبسبب حساسيتها العالية، فإن تقنية LAMP-CR عرضة للتلوث إذا لم يتم تنفيذها بعناية.

هذه بيئة مخصصة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ويولى اهتمام خاص للنظافة لكونها ذات أهمية قصوى. ولتضخيم الحمض النووي (DNA) المجهول المحيط بنجاح دون تلويث العينات، قم أولاً بتعريض المعقدات للفاصِل لمدة دقيقة واحدة، ثم أعد تعليق حبيبات الـ DNA في 100 µL من الماء.

بعد ذلك، قم بتعريض المعقدات لجهاز الفصل لمدة دقيقة واحدة. وفي هذه المرة، أعد تعليق معقدات DNA-bead في خليط يحتوي على 8.25 µL من الماء، و1 µL من HEXA nucleotide buffer، و0.25 µL من D DN NTPs، و0.5 µL من cano polymerase.

قم بتحضين هذا المزيج عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. ثم أضف 90 µL من الماء وعرّض التفاعل للفاصل لمدة دقيقة أخرى. بعد ذلك، قم بإعادة تعليق معقدات خرزات الـ DNA في 100 µL من غسول الماء.

استخدم جهاز الفصل لمدة دقيقة أخرى وجهز تفاعل إنزيم القطع. بعد إزالة الطافي، أضف 8.5 µL من الماء، و1 µL من منظم إنزيم القطع، و0.5 µL من إنزيم القطع.

عند اختيار إنزيم التقييد، تأكد من عدم وجود مواقع له داخل أو في اتجاه المصب من موقع الارتباط الأولي المستخدم في تفاعل التضخيم المسبق. بعد ترك الإنزيمات تتفاعل لمدة ساعة واحدة في درجة الحرارة المثالية، أضف 90 µL من الماء. استخدم جهاز فصل لمدة دقيقة واحدة وأعد تعليق معقدات BDNA في محلول غسيل مكون من 100 µL من الماء.

كرر عملية الفصل وقم بتجهيز تفاعل الربط. أضف إلى الخرزات 5 µL من الماء، و 1 µL من 10 x fast link buffer، و 1 µL من TP، و 1 µL من fast link DNA ligase، و 1 µL من كاسيت الرابط (linker cassette) الذي تم تحضيره في بداية الإجراء.

اترك هذا التفاعل يستمر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أوقف التفاعل بإضافة 90 µL من الماء وفصل الحبيبات، يليه غسل في 100 µL من الماء. ثم قم بعملية فصل أخرى لتمسخ الـ DNA المُصنّع، وأعد تعليق الحبيبات في 5 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 normal، واترك الخليط يُرج لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، افصل المعقدات لمدة دقيقة واحدة واجمع السائل العلوي (SUP)، الذي يحتوي على وصلة جينوم الناقل المضخمة مسبقاً. انتقل فوراً إلى مرحلة التضخيم الأسي أو قم بالتخزين عند درجة حرارة -20 °C. ابدأ بتعريض المعقدات للفاصِل لمدة دقيقة واحدة.

ثم أعد تعليق حبيبات DNA في 100 µL من الماء. ثم افصلها مرة أخرى وأزل الطافي. وبالنسبة لتفاعل الربط، أضف 6.5 µL من الماء، و1 µL من circ Ligase، و10x من محلول التفاعل المنظم (reaction buffer).

نصف ميكرولتر من magnesium chloride، ونصف ميكرولتر من TP، وميكرولتر واحد من SS linker oligos، ونصف ميكرولتر من cir ligase. بعد مرور ساعة واحدة عند 60 °C، يتم إيقاف التفاعل بإضافة 90 µL من الماء، وباستخدام فاصل الخرزات Resus يتم تعليق الخرزات في 100 µL أخرى من المنظم، ثم يُستخدم الفاصل مرة أخرى وجمع معقدات الغسل في 10 µL من الماء. ابدأ بتحضير المزيج الرئيسي لـ PCR كما هو موضح في الجدول 3 من النص.

أضف 48 µL من المزيج الرئيسي (master mix) إلى 2 µL من منتجات lamb أو NR lamb في أنابيب PCR سعة 200 µL، ثم قم بإجراء تفاعل PCR كما هو موضح في النص. مسبقاً، قم بتحضير المزيد من حبيبات strept وقم بإعادة تعليقها في كلوريد الليثيوم بتركيز 6 M. استخدم 20 µL لـ lamb أو 50 µL لـ NR lamb. بعد ذلك، أضف الحبيبات إلى نفس الحجم من نواتج تفاعل PCR واحضنها على جهاز هزاز بسرعة 300 RPM لمدة تتراوح من ساعتين إلى ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة، ثم اجمع معقد DNA-bead واغسله بـ 100 µL من الماء كما تم توضيحه سابقاً.

الآن، قم بتعليق المعقد في هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 normal وحضن الحبيبات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز. بعد ذلك، عرّض الحبيبات للفاصِل لمدة دقيقة واحدة واجمع الطافي الذي يحتوي على DNA المُضخّم في أنبوب جديد. باستخدام DNA المُضخّم كقالب، استخدم 2 µL منه لإجراء تفاعل PCR كما هو موضح في الجدول 4 من النص.

قم بتصور النواتج باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام لتنقية النواتج. اخلط 40 µL منها مع 44 µL من حبيبات am pure XP المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة، واحضنها لمدة خمس دقائق. ثم افصل الحبيبات لمدة دقيقتين باستخدام المغناطيس.

بعد إزالة المادة الطافية، اغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 µL من الإيثانول بتركيز 70%، ثم أعد تعليق الخرزات و30 µL من الماء باستخدام 40 ng من بادئ اندماج DNAA. يمكن استخدام تفاعل PCR لإضافة مهيئات خاصة بالتسلسل. التفاصيل موضحة في الجدول 5.

افحص النواتج على هلام. يُعد عرض نتائج PCR لـ lamb عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام عالي الدقة الخيار الأفضل للتحليل التشخيصي بالمقارنة. ورغم أن 2%aros يعمل أيضاً، إلا أنه لا يعمل بنفس الكفاءة.

لا يمكن تشخيص النسيلية لـ NR LAMB ومنتجات PCR بصرياً. ومع ذلك، فإن هلام الأجاروز بتركيز 2% كافٍ تماماً لتحديد مدى نجاح البروتوكول. وبعد تسلسل منتجات PCR، يمكن تحديد مواقع الناقلات في جينوم المضيف.

من خلال هذه البيانات، يمكن تسجيل مواقع الإدراج في المناطق المشفرة، وبالقرب من مواقع بدء النسخ بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج الجيني لاستكشاف السلامة الحيوية لناقلات نقل الجينات في كل من النماذج قبل السريرية وكذلك في تجارب العلاج الجيني السريرية.