الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد المواضع الدقيقة لدمج النواقل الفيروسية في الجينوم. يتم تحقيق ذلك من خلال تفاعل PCR خطي أولي مع بادئات بيوتينيل لإثراء تسلسلات تقاطع الجينوم المتجه من الحمض النووي الجيني في المرحلة الصلبة في سلسلة من التفاعلات ، يتم إنشاء الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل مع تسلسلات الحمض النووي المعروفة على طرفي المنتج ، مما يسمح بالتضخيم الأسي لتقاطعات الجينوم المتجه. تم دمج محولات التسلسل التالية في منتجات PCR للحمل.

من أجل تسلسل وتوصيف الحمض النووي المجاور غير المعروف بالتسلسل العميق ، تكشف هذه الأجزاء عن المواضع الدقيقة لتكامل المتجهات. والنتيجة هي مجموعة متنوعة من التقاطعات المضخمة كما يراها الرحلان الكهربائي الهلامي. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتوزيع موقع تكامل النواقل الفيروسية في مرضى العلاج الجيني السريري.

يمكن تطبيقه أيضا على دراسات أخرى مثل الإدراج ، والطفرات ، والشاشات ، والعدوى الفيروسية ، والسرطان ، واستنساخ الخلايا الجذعية أو تنوع الخلايا التائية. سيتم توضيح الإجراء بواسطة ina RA ، فني من مختبري لهذا الإجراء ، قم أولا بإعداد أشرطة الرابط امزج 40 ميكرولترا من كل من LCO Legos مع 110 ميكرولتر من هيدروكلوريد tris ، و 10 ميكرولترات من كلوريد المغنيسيوم في أنبوب طرد مركزي صغير. بعد ذلك ، اضبط الخليط على كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في اليوم التالي ، أضف 300 ميكرولتر من الماء إلى الرابط المزدوج الذي تقطعت به السبل ، الحمض النووي ، وقم بتصفيته عبر أنبوب طرد مركزي صغير. قم بتدوير المرشح لأسفل لجمع الحمض النووي للرابط المركز في ouit. بعد ذلك ، استرجع ouit من الفلتر.

أضف 80 ميكرولتر من الماء إلى الوعاء والماصة. 10 ميكرولتر في أنابيب PCR. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تقاطعات الجينوم المتجه مسبقا في أنبوب تفاعل 50 ميكرولتر للحمل.

أضف ما بين نانوجرام واحد وميكروغرام واحد من عينة الحمض النووي لكل تفاعل 50 ميكرولتر. بالنسبة للحمل NR ، استخدم ما لا يقل عن 100 نانوجرام من الحمض النووي. لا تضيف أكثر من 25 ميكرولترا من تنفيذ PCR وفقا للجدول الثاني في النص.

وعند الانتهاء ، أضف 0.5 ميكرولتر إضافي من التكنولوجيا إلى كل تفاعل وقم بتشغيل برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل مرة ثانية. أولا ، قم بإعداد الخرز المغناطيسي. أضف 20 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المطلي ب STREPT ENC إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر وضعه على فاصل الخرز المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم تخلص من رفع الطافف. قم بتعليق الخرزات في 40 ميكرولتر من PBS مع BSA وأعد الخرزات إلى الفاصل لمدة دقيقة أخرى. استبدل المادة الطافية بغسل 20 ميكرولتر من محلول كلوريد الليثيوم المولي.

ومرة أخرى ، ضع الخرز على الفاصل لمدة دقيقة. قم بإنهاء ذلك باستبدال المادة الطافية ب 50 ميكرولترا من محلول كلوريد الليثيوم السداسي مولاري. أضف الآن مزيج الخرزة المغناطيسية إلى ناتج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واترك هذا الخليط يحتضن لمدة ساعتين إلى ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف.

سيشكل الحمض النووي الحيوي وشريط التافا والخرز المطلي مجمعات يمكن تخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أيام. استمر في تناول لحم الضأن أو لحم الضأن بسبب حساسيته العالية. L-A-M-P-C-R عرضة للتلوث إذا تم تنفيذه باهتمام.

هذه بيئة من فئة PCR. واهتمام خاص بالنظافة ذات الأهمية القصوى. لتضخيم الحمض النووي المجهول المحيط بنجاح دون تلويث العينات ، قم أولا بتعريض المجمعات للفاصل لمدة دقيقة وقم بتعليق حبات الحمض النووي في 100 ميكرولتر من الماء.

بعد ذلك ، قم بتعريض المجمعات للفاصل لمدة دقيقة. وهذه المرة أعد تعليق مجمعات حبة الحمض النووي في خليط مع 8.25 ميكرولتر من الماء. ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت للنيوكليوتيدات HEXA ، وربع ميكرولتر من D DN NTPs ، ونصف ميكرولتر من بوليميراز الكانو.

احتضن هذا الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة. ثم أضف 90 ميكرولترا من الماء وقم بتعريض التفاعل للفاصل لمدة دقيقة أخرى. ثم أعد تعليق مجمعات حبة الحمض النووي في غسل 100 ميكرولتر من الماء.

استخدم الفاصل لمدة دقيقة أخرى وقم بإعداد تفاعل إنزيم التقييد. بعد إزالة المادة الطافية. أضف 8.5 ميكرولتر من الماء ، وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت لإنزيم التقييد ، ونصف ميكرولتر من إنزيم التقييد.

عند اختيار إنزيم التقييد ، تأكد من عدم وجود مواقع في موقع الارتباط البدائي المستخدم في تفاعل التضخيم الأولي أو في اتجاه مجرى النهر منه. بعد السماح للإنزيمات بالتفاعل لمدة ساعة عند درجة الحرارة المثالية ، أضف 90 ميكرولترا من الماء. استخدم فاصلا لمدة دقيقة وأعد تعليق مجمعات BDNA في غسل 100 ميكرولتر من الماء.

كرر الفصل وقم بإعداد تفاعل الربط. أضف إلى الخرزات خمسة ميكرولترات من الماء ، ميكرولتر واحد من 10 × عازلة الارتباط السريع. ميكرولتر واحد من TP ميكرولتر واحد من ليغاز الحمض النووي سريع الارتباط وميكرولتر من كاسيت الرابط الذي تم إجراؤه في بداية الإجراء.

اترك هذا التفاعل يعمل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإنهاء التفاعل بإضافة 90 ميكرولتر من الماء وفصل الخرزات ، متبوعا بغسل 100 ميكرولتر من الماء. ثم فصل آخر لتغيير طبيعة الحمض النووي المركب يعلق الخرزات في خمسة ميكرولترات من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي ، ويسمح للخليط بالاهتزاز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم افصل المجمعات لمدة دقيقة واجمع SUP natin ، الذي يحتوي على تقاطع جينوم المتجه المضخم مسبقا. تابع على الفور التضخيم الأسي أو قم بتخزينه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. ابدأ بتعريض المجمعات للفاصل لمدة دقيقة.

وتعليق حبات الحمض النووي في 100 ميكرولتر من الماء. وافصلهم مرة أخرى وأزيلي المادة الطافية. لتفاعل الربط ، أضف 6.5 ميكرولتر من الماء ، ميكرولتر واحد من الليغاز الدائري ، 10 × عازلة التفاعل.

نصف ميكرولتر من كلوريد المغنيسيوم ، ونصف ميكرولتر من TP ، وميكرولتر واحد من أوليغوس رابط SS ، ونصف ميكرولتر من cir ligase. بعد ساعة عند 60 درجة مئوية ، قم بإنهاء التفاعل ب 90 ميكرولتر من الماء باستخدام فاصل الخرزة Resus ، مع تعليق الخرز في 100 ميكرولتر آخر من واحد ، باستخدام الفاصل مرة أخرى وجمع مجمعات الغسيل في 10 ميكرولتر من الماء. ابدأ بإعداد مزيج رئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في الجدول الثالث من النص.

أضف 48 ميكرولترا من المزيج الرئيسي إلى ميكرولترين من لحم الضأن أو منتجات لحم الضأن NR في أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر وقم بتشغيل PCR كما هو موضح في النص كما كان من قبل ، وقم بإعداد المزيد من الخرز وإعادة تعليقها في ستة كلوريد الليثيوم المولارية. استخدم 20 ميكرولترا للضأن أو 50 ميكرولترا للخروف NR. ثم أضف الخرزات إلى نفس الحجم من منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واحتضانها على شاكر بسرعة 300 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين إلى ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة ، واجمع مركب حبة الحمض النووي واغسله ب 100 ميكرولتر من الماء كما هو موضح سابقا.

الآن ، قم بتعليق المركب في 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي واحتضان الخرزات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر. ثم قم بتعريض الخرزات للفاصل لمدة دقيقة واجمع المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي المضخم في أنبوب جديد. باستخدام الحمض النووي المضخم كقالب ، استخدم ميكرولترين منه لتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في الجدول الرابع من النص.

تصور المنتجات عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام لتنقية المنتجات. امزج 40 ميكرولترا منها مع 44 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي النقي بدرجة حرارة الغرفة ، واحتضنها لمدة خمس دقائق. ثم افصل الخرزات لمدة دقيقتين على المغناطيس.

بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول ، ثم أعد تعليق الخرزات و 30 ميكرولترا من الماء باستخدام 40 نانوجراما من برايمر اندماج الحمض النووي. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لإضافة محولات محددة للتسلسل. وترد التفاصيل في الجدول الخامس.

تحقق من المنتجات على مادة هلامية. يعد عرض نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة للهلام هو أفضل خيار للتحليل التشخيصي بالمقارنة. بينما يعمل 2٪ aros أيضا ، إلا أنه لا يعمل بشكل جيد.

يمكن تشخيص استنساخ NR LAMB ، منتجات PCR بصريا. ومع ذلك ، فإن جل 2٪ agros كاف تماما لتحديد نجاح البروتوكول. بعد تسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكن العثور على موقع النواقل في جينوم المضيف.

من هذه البيانات ، من الممكن تسجيل مواقع الإدراج في مناطق الترميز ، وبالقرب من مواقع بدء النسخ بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج الجيني لاستكشاف السلامة الحيوية لنواقل نقل الجينات في كل من النماذج قبل السريرية وكذلك في تجارب العلاج الجيني السريري.