الخلايا العصبية الشمية التي يتم الحصول عليها من خلال الأنف خزعة جنبا إلى جنب مع الليزر والتقاط تسليخ مجهري: نهج المحتملين لدراسة الاستجابة للعلاج في اضطرابات العقلية

يوضح هذا الإجراء بالتفصيل استخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لعزل الطبقات العصبية من أنسجة الظهارة الشمية ، كما يحدد بعض تحليلات التعبير الجيني في اتجاه مجرى النهر. ابدأ بخزعة الأنف للحصول على أنسجة الظهارة الشمي. ثم قم بإجراء التشريح المجهري لالتقاط الليزر لعزل الطبقات العصبية.

بعد ذلك ، عزل الحمض النووي الريبي من العينات. النسخ العكسي ل CDNA وتحليل التعبير الجيني بواسطة QPCR. في النهاية ، يتم استخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لإظهار أنه يمكن عزل مجموعة غنية من الخلايا العصبية من أنسجة الظهارة الشمية وتطبيقها على العديد من التطبيقات النهائية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على المعادن الموجودة مثل مزارع الخلايا العصبية ، هي أنها تسمح لنا بدراسة كل من الحالة والتغيرات الديناميكية في سياق الخلايا العصبية. خطرت لنا فكرة هذا المشروع لأول مرة عندما اكتشفنا إمكانية الجمع بين التشريح الدقيق لالتقاط الليزر والخزعات الشمية للحصول على مجموعات عصبية مخصبة. تم إنشاء هذه الطريقة وإثباتها من قبل TDA على الإطلاق.

لقد توسعنا في هذه المنهجية وقمنا بدمج تحليل Q-R-T-P-C-R في المرضى والضوابط التي توضح أن الإجراء سيكون تشين تشونغ ، فني من فريقنا في جامعة جونز هوبكنز. سيتم تصوير الإجراءات التالية في مرافق جونز هوبكنز مباشرة قبل التشريح المجهري. دع الشرائح المجمدة تذوب لمدة 10 ثوان ، ثم قم بتجفيف الأنسجة باستخدام سلسلة الإيثانول باستخدام الأوقات والأحجام الموضحة في بروتوكول النص.

قم بتشغيل المجهر لتنشيط الصورة. يحدد الفحص المجهري شروط التكبير 10 × كطاقة 82 ، والتركيز البؤري 74 والسرعة من 25 إلى 30 للتكبير 20 ×. اضبط الطاقة على 63 ، والتركيز على 67 والسرعة إلى خمسة إلى ستة.

الآن حدد الخلايا العصبية بصريا باستخدام تكبير 20 × أو 10 ×. يميز طبقة الخلايا العصبية الشمية الرقيقة السطحية عن تحت الغشاء المخاطي الأساسي تحت المجهر دون استخدام إجراء تلطيخ. لاحظ الخلايا العصبية كمظهر عمودي كثيف باستخدام وظيفة القلم الرصاص.

تتبع حول الطبقة العصبية ، وتتبع بعيدا قليلا عن الخلايا العصبية لمنع حرق الخلايا العصبية من الليزر للحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة. ثم ابدأ القطع الموجه بالليزر. التقط الأقسام التي تم تشريحها باستخدام ملقط التشريح الدقيق ذو الطرف الدقيق ، وانقل الأنسجة إلى أنبوب دقيق يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول التحلل على الجليد.

كرر التشريح لجميع الأقسام العصبية التي تم الحصول عليها من عينة واحدة في غضون 50 دقيقة من الوقت الإجمالي عند الانتهاء من التشريح ، وقم بدوامة العينة على الفور واحتفظ بها على الثلج الجاف. ثم قم بتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي بالكامل. قم بإذابة العينة المحللة على الجليد.

قم بإجراء عزل كامل للحمض النووي الريبي باستخدام المجموعة الصغيرة المائية RN مع الحمض النووي تعطيل واحد باتباع بروتوكول الشركة المصنعة دون أي تعديلات. يتخلص من 20 ميكرولتر. باستخدام المحلل الحيوي ، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي وتقييم جودة الحمض النووي الريبي برقم سلامة الحمض النووي الريبي.

حدد العينات التي تفي بمعايير مراقبة الجودة لتوليف CDNA تخليق CDNA باستخدام مجموعة تجارية تم التحقق من صحتها لكل أنبوب تفاعل. ANIL 0.1 إلى 1.0 نانوجرام من الحمض النووي الريبي في حجم إجمالي يبلغ ثمانية ميكرولتر من الماء الحر من الحمض النووي الريبي ، وميكرولتر واحد من أوليغو DT التمهيدي وميكرولتر واحد من 10 مللي مولار DNTP Mix. قم بتدوير العينات برفق ، وجهاز الطرد المركزي ، والأنيل عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد اكتمال التفاعل ، ضع العينات على الفور على الجليد. تحضير محلول الخلطة الرئيسي كما هو موضح. ثم أضف 9.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي و 0.5 ميكرولتر من النسخ العكسي المحضر تجاريا إلى كل أنبوب عينة إلى أنبوب التحكم عند 0.5 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي.

بدلا من إنزيم RT ، قم بتشغيل تفاعل RT مع الحضانة الأولى عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. ثم 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. وأربع درجات مئوية أخيرة.

خفف جميع العينات خمس أضعاف بالماء وكمية لتحديد التخصيب العصبي لتعبير بروتين العلامة الشمية. قم بإعداد حلول الخلطات الرئيسية PCR باستخدام التحكم الداخلي G-A-P-D-H لكل بئر من لوحة PCR. أضف سبعة ميكرولترات من المزيج الرئيسي وثلاثة ميكرولترات من CDNA.

ثم الطرد المركزي للوحة لمدة خمس دقائق عند 300 جرام. قم بتشغيل تفاعل PCR في الوقت الفعلي باستخدام شروط التدوير الحراري الافتراضية المحددة للمزيج الفائق التجاري. تحليل نتائج التعبير لإثراء الطية.

حدد العينات التي تظهر تخصيب الخلايا العصبية بمقدار ضعفين أو أكثر. بعد ذلك ، قم بتصميم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للتعبير عن الجينات ذات الأهمية باستخدام مسبار مثير للاهتمام مسمى FAM و VIC المسمى G-A-P-D-H. قم بإعداد لوحة PCR مع ثمانية ميكرولترات من المزيج الرئيسي في كل بئر ولترين من الطرد المركزي CDNA على اللوحة لمدة خمس دقائق.

عند 300 جرام. قم بتشغيل التفاعل باستخدام ظروف التدوير الحراري الافتراضية وفقا لبروتوكول المزيج الرئيسي للتعبير الجيني المقدم من الشركة المصنعة. الآن قم بتحليل نتائج التعبير.

استخدمت هذه التجربة التقاط الليزر والتشريح الدقيق و R-T-P-C-R لقياس تأثير الليثيوم على مستويات التعبير عن سينسيز الجليكوجين سينسيز كيناز ثلاثة بيتا في الظهارة الشمية في هذين المريضين اللذين يعانون من تحليل تعبير الاضطراب ثنائي القطب قبل وبعد العلاج بالليثيوم في هذين المريضين المصابين بداء بيهتين إلى انخفاض في تعبير GSK ثلاثي بيتا بينما لم يظهر الأشخاص الضابطون أي تغيير كبير بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب النفسي العصبي لاستكشاف التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية للمريض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لعزل مجموعة غنية من الخلايا العصبية ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحليل التعبير الجيني النهائي.