تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم نضج الخيوط العضلية والخلايا العضلية القلبية في قلب الجنين الفأري النامي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توجيه وتجميد قلب الجنين في وسط التقطيع. بعد ذلك، يتم إجراء تقطيع تجميدي للقلب في التوجه الصحيح.

بعد ذلك، تخضع قطاعات القلب للوسم المناعي الفلوري للبروتينات المستهدفة. وأخيراً، يتم إجراء المجهر البؤري لقطاعات القلب المصبوغة مناعياً. وفي النهاية، تُستخدم تحليلات الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لإظهار تطور MyFi والهياكل الخلوية الأخرى للخلايا العضلية القلبية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال تطور القلب، مثل كيفية تأثير الطفرات والجينات القلبية على تجميع MyFi وظهور هياكل محددة مثل الأقراص البينية والـ costumers. وللتجميد السريع للقلوب الجنينية، استخدم وسط درجة حرارة القطع المثالية أو وسط OCT لملء طبق بتري بحجم 3.5 centimeter داخل غطاء كيميائي. يتم تبريد Two methyl butane في النيتروجين السائل.

بعد عزل قلوب الأجنة الفأرية وفقاً للبروتوكول النصي، ضع القلوب في OCT واتركها لتتوازن لعدة ثوانٍ قبل نقلها إلى قالب بحجم سبعة مليمترات يحتوي على OCT. وجه الجدار الداخلي للقلب نحو قاع القالب. ضع القالب برفق في 2-methylbutane المبرد بالنيتروجين السائل.

احرص على عدم السماح لسائل ميثيل البوتان المزدوج بملامسة مركب OCT أو القلب المجمد حتى يصبح مركب OCT أبيض اللون وصلباً. ثم انقل القالب إلى دلو ثلج يحتوي على ثلج جاف. بعد تجميد جميع القلوب، قم بلف قوالب التجميد بورق ألومنيوم وخزنها في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت التقطيع بالتجميد.

لتثبيت القلوب الجنينية، استخدم 4%PFA في PBS لملء آبار طبق زراعة مكون من 12 بئراً. بعد استئصال القلوب الجنينية وفقاً للبروتوكول المكتوب، ضع كل قلب في بئر من PFA وثبته عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. وللحماية من التجمد، انقل كل قلب باستخدام ماصة نقل بلاستيكية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1.5 مل من 15%Sucrose في PBS، ورجه بلطف عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يغوص القلب إلى قاع الأنبوب. ثم انقل كل قلب إلى 30%sucrose في PBS ورجه بلطف عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يغوص القلب إلى قاع الأنبوب.

جمد الأجنة في مركب OCT كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو. بعد وضع قوالب التجميد في حجرة الميكروتوم المجمد (cryostat) ومساواتها بدرجة حرارة -17 °C، اقلب قالب التجميد واستخدم ضغطاً خفيفاً لإخراج كتلة القلب من القالب. وجه الجدار الأمامي للقلب ليكون في الجزء العلوي من كتلة النسيج المصبوبة.

ضع قطرة كبيرة من مركب OCT على القاعدة، ثم ثبّت كتلة القلب فوق قطرة OCT. حافظ على الوضعية بحيث يكون الجدار الأمامي للقلب هو الأبعد عن القاعدة. اترك القلب يتجمد فوق القاعدة.

ضع القرص وكتلة القلب المثبتة على حامل عينات الميكروتوم المجمد (cryostat). اضبط الزاوية بحيث تكون زاوية الشفرة من ثلاث إلى خمس درجات بالنسبة للعينة. اجمع مقاطع بسمك 10 micrometer على شرائح مجهرية تمت معالجتها مسبقاً بطلاء موجب الشحنة.

اترك العينات لتجف تماماً قبل تخزينها في درجة حرارة 80- درجة مئوية لإجراء الفلورة المناعية. بعد تثبيت ومسح مادة OCT من المقاطع، استخدم محلول حجب بتركيز 1x مخفف في PBS للحجب لمدة 45 دقيقة مع الرج اللطيف. في حال استخدام جسم مضاد أولي مُنتج في الفأر، أضف جزء FAB أحادي التكافؤ مضاد لـ IgG H plus L الخاص بالفأر من الحمار أو الماعز، مخففاً بنسبة 1:100 في PBS 0.1%tween 20، ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع الرج اللطيف.

أضف الجسم المضاد الأولي أو الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول حجب (blocking buffer) بتركيز 1x، ثم قم بالتحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 °C طوال الليل. بعد انتهاء التحضين، استخدم محلول 1x PBS لغسل المقاطع ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، أضف جسماً مضاداً ثانوياً مقترناً مخففاً بنسبة 1:500 في محلول الحجب إلى العينات، ثم قم بالتحضين لمدة ساعتين مع الحماية من الضوء.

في درجة حرارة الغرفة، استخدم XPBS لغسل المقاطع ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة مع الحماية من الضوء. قم بتثبيت الشرائح باستخدام وسط مضاد للتلاشي (anti fade medium) عن طريق وضع قطرتين من الوسط على كل طرف من الشريحة، ثم استخدم غطاءً زجاجياً للتغطية. استخدم طلاء الأظافر لختم الأغطية الزجاجية.

يُحفظ عند درجة حرارة 4 °C، بعيداً عن الضوء حتى يحين وقت التصوير. باستخدام عدسة شيئية بقوة 4x وتقنية الفلورة الليزرية، يتم تحديد العينة والمنطقة المراد دراستها. يتم التقاط الصورة لاستخدامها كخريطة توجيهية.

عند التصوير بتكبير عالٍ، قم بإزالة الشريحة مع إجراء أدنى قدر من التعديلات على منصة الشريحة. ثم انتقل إلى استخدام عدسة شيئية غمر زيتي بقوة 60 x.

ضع قطرة صغيرة من الزيت على العدسة الشيئية وأعد الشريحة إلى منصة العينات. بعد ذلك، حدد موقع العينة مرة أخرى، ثم اضبط وقت التعرض لقوة الليزر وعملية التجميع (binning) إلى المستويات المطلوبة لكل قناة. وبمجرد تحديد الإعدادات المثالية وفقًا لإرشادات البروتوكول النصي، استخدم إعدادات العينة هذه لجميع المقاطع النسيجية ضمن التجربة.

استخدم مدرج التكرار للكثافة (intensity histogram) لتحديد نطاق الكثافة الأمثل لكل قناة، والذي سيُستخدم في التحليل. قم بإنشاء مكدس زد (Z stack) باستخدام دالة الاستحواذ عن طريق اختيار قنوات الليزر المناسبة. ثم حدد الحدود العليا والسفلى لمكدس زد (Z stack).

اختر حجم خطوة Zack يكون نصف قيمة سمك الشريحة الضوئية التي يوفرها البرنامج. انقر على "تشغيل" (run) لجمع الصور باستخدام برنامج Fiji أو أي برنامج مماثل لتحليل الصور. افتح ملف Zack باستخدام خيار وضع الألوان المخصص مع تقسيم القنوات إلى نوافذ منفصلة.

من القائمة المنسدلة للصورة، افتح أداة ضبط السطوع والتباين (adjust brightness contrast) وقم بتعيين نطاق كثافة المدرج التكراري الأمثل داخل كل قناة. ووفقاً لما تم تحديده مسبقاً، قم بتطبيق نطاقات القنوات هذه على جميع عينات Zacks التي يتم تحليلها. ثم من القائمة المنسدلة لألوان الصورة، ادمج القنوات الفردية في صورة مركبة واحدة.

باستخدام قائمة Project في Image Stacks Z، قم بإنشاء مسقط رأسي (flattened Z stack) من الصورة المركبة. وبما أن هذه الصورة ستكون أكثر سطوعاً بشكل ملحوظ من الصورة ثلاثية الأبعاد، قم بضبط نطاق كثافة المدرج التكراري (histogram intensity range) لعينة التحكم لتجنب التشبع المفرط، ثم طبق الإعدادات نفسها على المسقط الرأسي للعينة التجريبية. ولتوليد صورة ثلاثية الأبعاد، اختر أولاً قائمة Project في Image Stacks 3D، ثم حدد محور الدوران إما المحور X أو المحور Y.

اضبط تباعد الشرائح ليكون بنفس عدد الميكرونات الخاص بحجم خطوة المكدس Z. اختر إجمالي الدوران المطلوب واضبط زيادة زاوية الدوران على واحد. بعد ذلك، افتح عارض ImageJ 3D من القائمة المنسدلة للإضافات (plugins).

اختر عرض الصورة المركبة الناتجة كحجم (volume) واضبط عامل إعادة أخذ العينات (resampling factor) على واحد أو اثنين. تظهر هذه الأشكال النتائج النموذجية للتلوين المشترك لبروتينات مختلفة في قلب مثبت بالأسيتون ومجمد سريعاً، حيث قام الجسم المضاد ضد S alpha actinin بتمييز أقراص Z وأقراص البين تلوية (intercalated discs) بشكل متكرر وبنوعية عالية مع حد أدنى من الضجيج الخلفي. ارتبط الجسم المضاد لبروتين وصلة الالتصاق beta-catenin بغشاء كل من الخلايا العضلية القلبية والخلايا غير العضلية القلبية، وحدث التوضع المشترك مع SFA actinin في أقراص البين تلوية المفترضة عند المرحلة E 16.5. يعد التألق المناعي لـ beta one Integrin في القلب الجنيني تحدياً خاصاً، إلا أن تلوين beta one integrin في هذه الدراسات كشف عن إشارة بنفس دورية أقراص Z التي ميزها SFA Actinin، مما قد يعكس تكوين جسيمات costamers الناشئة عند المرحلة E 16.5.

عند المرحلة E 12.5، أظهر نمط صبغ SFA actinin وtropo myosin دورية منتظمة في الخلايا العضلية القلبية التربيقية، وهو ما يتفق مع اللييفات العضلية الناضجة في المنطقة المدمجة الخارجية. كان صبغ SFA actinin أكثر نقطية منه خطية، وكانت إشارة tropo myosin منتشرة بدلاً من أن تكون خطية. تزامنت صبغة NCA الملتصقة والخلايا العضلية القلبية التربيقية في قلوب المرحلة E 12.5 مع مناطق ذات صبغ مكثف لـ SFA actinin، والتي قد تمثل الأقراص المقحمة. يظهر هنا (A) قلب جنيني في المرحلة E 12.5 مثبت بـ PFA وموسوم لـ SFA actinin وfilamentous acton من فأر transgenic يحمل life act RFP Ruby. انخفضت نسبة الإشارة إلى الضجيج لـ SFA actin مقارنة بمقاطع القلب المجمدة سريعاً.

كشف إعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد أن MyFi داخل الخلية القلبية كانت متوازية تقريباً مع بعضها البعض، ولكن الخلايا القلبية الفردية كانت موجهة بزوايا متفاوتة بالنسبة لبعضها البعض. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توجيه وتقطيع تجميد القلوب الجنينية بشكل صحيح، بالإضافة إلى إجراء الصبغ المناعي، والمجهر البؤري، وتحليل الصور لتقييم نضج MyFi والخلايا القلبية أثناء تطور قلب الفأر.