تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية
February 24th, 2017
للتمييز بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية في خلايا عضلة القلب ، نقدم بروتوكولات باستخدام خطين من الفئران المعدلة وراثيا: الفئران المعدلة وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وفئران CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلايا عن اختلافات دورة الخلية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور نشاط دورة الخلية في خلايا عضلة القلب بعد الولادة وتحديد نويتها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد القلب ، مثل هل تنقسم خلايا عضلة القلب حقا أم أنها تزيد فقط من تعدد النوى أو تصبح متعددة النوى؟ تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن تصور المرحلة M من دورة الخلية بدقة زمانية مكانية عالية ويمكن تحديد نوى خلايا عضلة القلب عن طريق التألق.
ستظهر الإجراء باتريشيا فريتاج ، فنية من مختبرنا. في حالة استخدام أزواج تكاثر غير متماثلة اللواقح ، حدد أولا القلوب المعدلة وراثيا عن طريق المجهر الفلوري للتحقق من تعبير أنالين EGFP و H2B-mChery. يمكن اكتشاف الإشارات النووية لتحليل EGFP بسهولة عند حواف الأذينين من خلال التركيز من خلال طبقات الأنسجة.
لعزل خلايا عضلة القلب ، ضع العدد المناسب من القلوب في أنابيب تفاعل سعة 1.5 مليلتر تحتوي على مليلتر واحد من مزيج الإنزيم من مجموعة تفكك قلب حديثي الولادة وتقطيع القلوب إلى قطع صغيرة بالمقص. ثم انقل المحلول إلى أنابيب تفاعل سعة 15 ملليلترا. ضع الأنبوب في وضع أفقي تقريبا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، واخلط الأنسجة من خمس إلى 10 مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر في نهاية الحضانة.
في نهاية الهضم الثالث ، أوقف التفاعل ب 7.5 مل من متوسط اثنين وقم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون. اشطف مصفاة الخلية بثلاثة ملليلتر من متوسط اثنين ، وقم بتجميع الغسيل مع الخلايا المجمعة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من متوسط واحد للعد.
بعد ذلك ، قم بالبذور مرة واحدة في عشرة إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في 120 ميكرولترا من الخلايا المتوسطة في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا وقم بالطرد المركزي للخلايا قبل زراعتها الليلية في حاضنة زراعة الخلايا. في اليوم التالي ، يجب أن تنبض معظم خلايا عضلة القلب. قبل البدء في التعدي ، امسح المقعد وجميع مواد التعدي بمحلول إزالة التلوث RNAse لإزالة أي RNAse.
عندما تصبح جميع المواد جاهزة ، أضف 20 ميكرولترا من مزيج siRNA المحضر حديثا إلى كل بئر وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة. بعد يومين ، استبدل المادة الطافية في كل بئر ب 120 ميكرولتر من متوسط واحد وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى على الأقل. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، متبوعا بالتثبيت في محلول فورمالديهايد بنسبة 4٪ لمدة 20 دقيقة.
لتحليل الخلايا عن طريق الفحص المجهري بالفيديو متحد البؤر ، انقل اللوحة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر وابدأ تشغيل برنامج التصوير. افتح إعدادات A1plus وحدد مربعات القناة واحدة واثنتين وثلاثة وأربعة. في القائمة المنسدلة، اضبط القناة الأولى على DAPI، والقناة الثانية على eGFP، والقناة الثالثة على RFP، والقناة الرابعة على Cy5.
انقر فوق جهد القناة واستخدم أشرطة التمرير لضبط الجهد على 80 لكل قناة. استخدم أشرطة التمرير لضبط الإزاحة على الصفر وانقر فوق زر الصفحة الرئيسية لضبط الثقب على موضع المنزل. اضبط حجم المسح الضوئي على 1024 × 1024 بكسل في القائمة المنسدلة.
انقر فوق تحسين لفتح نافذة إعداد حجم XYZ وحدد مربع voxel المثالي ضمن الخطوة المقترحة Z.حدد هدف 20x واضبط شدة الليزر حتى لا تكون الصورة أقل أو مفرطة في التعريض. عند تعيين جميع المعلمات، افتح قائمة الاكتساب. حدد مسح صورة كبيرة ضوئيا ثم اختر الموضع الحالي في الزاوية العلوية اليسرى أسفل المنطقة.
ثم اضبط عدد الحقول في X و Y على ثلاثة في ثلاثة وانقر فوق مسح. لتحديد عدد نوى خلايا عضلة القلب ، انقر فوق القياس والقياس اليدوي والعدد. حدد النوى بإشارات H2B-mCherry ، وبالتالي وضع علامة عليها وعدها.
ثم حدد الخلايا الموجبة ألفا أكتينين لتحديد عدد خلايا عضلة القلب. لحساب خلايا عضلة القلب في المرحلة G1 و S و G2 مع إشارات أنالين EGFP النووية ، حدد القياس والقياس اليدوي والعد. ضع علامة على أنالين EGFP و H2B-mCherry النوى الشفبرة عن طريق النقر وعد خلايا عضلة القلب يدويا بإشارات أنالين EGFP الخاصة بالانقسام مثل الحلقات المقلصة ومنتصف الجسم.
ثم انقر فوق القياس والقياس اليدوي والتعداد وانقر فوق خلايا عضلة القلب مع إشارات أنالين EGFP الخاصة بالانقسام ، والإشارات السيتوبلازمية ، والحلقات المقلصة ، ومنتصف الجسم. بالمقارنة مع الضوابط السلبية ، تظهر خلايا عضلة القلب المنقولة miRNA و siRNA تحريضا لنشاط دورة الخلية. تظهر خلايا عضلة القلب التي تقوم بإجراء التكرار الداخلي تعبيرا أنالين EGFP نواويا حصريا ، في حين أن خلايا عضلة القلب التي تخضع لانقسام الخلايا تعرض تعبير أنالين EGFP في التوطين النموذجي للمرحلة M.
بعد الهضم الأنزيمي لأنسجة القلب في جهاز Langendorff ، يمكن فصل الأذينين والبطينين ميكانيكيا وتحليلهما بشكل مستقل ، مما يسمح بتصور خلايا عضلة القلب البطينية المعدلة وراثيا H2B-mCherry مع عدد كبير من خلايا عضلة القلب ثنائية النواة الإيجابية H2B-mChery. على النقيض من ذلك ، فإن غالبية خلايا عضلة القلب الأذينية أحادية النواة. لا يؤدي الهضم الأنزيمي إلى كشف مجموعة من خلية واحدة بنسبة 100٪ عن نمط من الخطوط المتقاطعة عن طريق تلطيخ ألفا أكتينين ، مما يسهل التمييز بين خلايا عضلة القلب ثنائية النواة كنمط مستمر من التقاطعات المزدوجة والخلايا.
لتحليل مؤشر النواة الثنائية لخلايا عضلة القلب في شرائح سميكة ، من الضروري التمرير يدويا عبر المكدس لأن النوى لا تقع بالضرورة داخل مستوى Z واحد ، مع تلطيخ جنين القمح الذي يسمح باكتشاف الخلية borders. 3D تسمح إعادة بناء الشرائح الثابتة من قلوب الفئران المعدلة وراثيا البالغة بالكشف عن الخطافات وعدها آليا ، ملطخة ، و H2B-mCherry النوى الإيجابية لتحديد نسبة نوى خلايا عضلة القلب في ظل الظروف الفسيولوجية داخل الأنسجة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تفكك القلب في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل باستمرار للحفاظ على صلاحية الخلايا طوال التجربة. بعد هذا الإجراء ، من الممكن فحص microRNAs أو غيرها من المواد الصغيرة لإثارة التكاثر في خلايا عضلة القلب بعد الولادة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولات للتمييز بين انقسام الخلايا والاختلافات في دورة الخلية لخلايا عضلة القلب باستخدام خطوط الفئران المعدلة وراثيًا. تسمح الطرق بتصوير عالي الدقة لنوى خلايا عضلة القلب ونشاط المرحلة M.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- بيولوجيا الخلية
- الطب التجديدي
الخلفية
- فهم سلوك خلايا عضلة القلب أمر بالغ الأهمية لتجديد القلب.
- يمكن لعضلات القلب زيادة العدد الصبغي أو أن تصبح متعددة النوى دون الانقسام.
- توفر النماذج الفئران المعدلة وراثيًا أدوات لدراسة هذه العمليات.
- تساعد المجهر الفلوري في تحديد الأنشطة الخلوية المحددة.
هدف الدراسة
- لتصور نشاط دورة الخلية في خلايا عضلة القلب بعد الولادة.
- لتحديد النوية لعضلات القلب.
- لتوضيح ما إذا كانت عضلات القلب تنقسم أو تخضع لتغيرات العدد الصبغي.
الطرق المستخدمة
- استخدام الفئران المعدلة وراثيًا Myh6-H2B-mCh و CAG-eGFP-anillin.
- المجهرية الفلوري لتحديد نوى خلايا عضلة القلب.
- تصوير عالي الدقة المكانية والزمانية لمرحلة M من دورة الخلية.
- تحديد القلوب المعدلة وراثيًا قبل التحليل.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لنوى خلايا عضلة القلب باستخدام الفلورة.
- تمييز واضح بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية.
- تحديد إشارات أنيلين EGFP النووية في أنسجة الأذين.
- فهم محسن لسلوك خلايا عضلة القلب في التجديد.
الاستنتاجات
- توفر البروتوكولات طريقة موثوقة لدراسة انقسام خلايا عضلة القلب.
- تكون العلامات الفلورية فعالة في تحديد العمليات الخلوية.
- يساهم هذا البحث في مجال تجديد القلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cardiomyocyte proliferation versus polyploidization is critical for evaluating cardiac regeneration strategies in preclinical models. Misinterpretation of nuclear markers can lead to overestimation of true mitotic activity, impacting target validation and lead identification efforts. This method provides a mechanistic de-risking approach by distinguishing bona fide cell division from endoreduplication or acytokinetic mitosis, thereby improving predictive confidence in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cardiomyocyte proliferation by distinguishing true mitosis from DNA synthesis without cytokinesis.
- Operational Value: Uses fluorescent nuclear and mitotic markers to reduce ambiguity in cell cycle status assessment.
- Predictive Value: Supports target de-risking by clarifying whether a compound induces hyperplasia versus hypertrophic growth via ploidy increase.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable nuclear and mitotic signals compatible with high-content imaging for compound screening.
- Reproducibility: Standardized transgenic reporter systems allow consistent detection of cardiomyocyte nuclei and M-phase events across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and enzymatic dissociation workflows for medium-throughput screening of miRNAs or small molecules.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to postnatal cardiomyocyte models used in regenerative medicine target validation.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to tissue-level analysis via 3D reconstruction and automated nuclear counting in thick slices.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables differentiation between pro-proliferative and polyploidizing effects, informing go/no-go criteria in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for compounds modulating cardiomyocyte cell cycle dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing M-phase activity and nuclearity to clarify mechanisms of action.
- Screening: Enables assay standardization through fluorescent reporters, facilitating reliable compound evaluation in microtiter plates.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as nuclei count per cell, mitotic index, and binucleation rate for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects cellular observations to tissue architecture via confocal z-stacking and border detection using wheat germ agglutinin.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing cardiac regenerative potential across multiple compound classes and genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing false-positive proliferation signals from endoreduplication or acytokinetic mitosis.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized transgenic markers and defined imaging parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of compounds with genuine hyperplastic activity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by distinguishing mechanistic classes of cardiomyocyte response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, transgenic animal handling, and cardiomyocyte isolation techniques.
- Dependent on access to Myh6-H2B-mCh and CAG-eGFP-anillin mouse lines or equivalent dual-reporter systems.
- Necessitates standardized enzymatic digestion and plating procedures to maintain cell viability and staining fidelity.
- Involves manual measurement steps for nuclei and mitotic event counting, which may require inter-operator training for consistency.
- Limited by tissue accessibility and signal penetration in thick slices, necessitating optical clearing or sectioning for deep tissue analysis.
