بناء على أساس خلية العصبي نيون المهندسة مراسلون (CNiFERs) للكشف بصري من الناقلات العصبية في فيفو

الهدف العام من هذا الفيديو هو وصف منهجية بناء واختبار مراسلي الفلورسنت العصبي المستندين إلى الخلايا ، أو CNiFERs ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة إطلاق ناقلات عصبية معينة بصريا في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب فيما يتعلق بتوقيت وإطلاق المعدلات العصبية في الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تكييفها مع أي نوع من الناقلات العصبية أو المعدلات العصبية ، التي تشير من خلال GPCS.

العرض الإقليمي لهذه الطريقة مفيد. إنه الحقن في الجسم الحي ، والتصوير اللاحق ل CNiFERs يمثل تحديا تقنيا. لبدء هذا الإجراء ، راجع خلايا HEK293 التي تحتوي على كاشف الكالسيوم الأمامي وبروتين g الخيمري في قارورة T-25.

بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا في حاضنة رطبة ، عند 37 درجة مئوية ، مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون2 ، حتى حوالي 50٪ ملتقية. بعد ذلك ، استنشق الوسائط من قارورة T-25. أضف ملليلترين من خليط وسائط فيروس الصوام ، واحتضن قارورة T-25 عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، قم بحصاد خلايا HEK293 المصابة بإضافة مليلتر واحد من التربسين. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من وسائط النمو HEK293. قم بزرع مليلتر واحد من الخلايا في قارورة T-75 للتجميد والتخزين ، و 1.5 مل من الخلايا في قارورة T-25 لتحليل FACS.

بالنسبة لمنحنى ناهض 10 نقاط ، لاختبار الخلايا المصابة ، قم بزرع الصفين الأولين من صفيحة 96 بئر مطلية بالفيبرونيكتين مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر. بعد ذلك ، احتضان خلايا HEK293 التي تنمو في قارورة T-25 ، وقارورة T-75 ، وصفيحة 96 بئر حتى تلتقي حوالي 90٪ عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة يوم إلى يومين. قبل تحليل FACS ، حدد التعبير الوظيفي ل GPCR عن طريق تحضير صفيحة دواء ب 10 تركيزات ناهضة مختلفة تضع بين قوسين EC 50 المتوقع.

قم بإعداد تركيزات مختلفة من ناهض باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي ، وإنشاء قالب لتتبع تركيزات الدواء. بعد ذلك ، اضبط درجة حرارة قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم ببرمجة قارئ الألواح الفلورومترية 96 جيدا لقياس الحنق وإجراء عمليات نقل المحلول.

لقياس الحنق باستخدام مستشعر الكالسيوم القائم على الحنق المشفر وراثيا ، TNXXL ، اضبط الطول الموجي للإثارة عند 436 زائد أو ناقص 4.5 نانومتر. بعد ذلك ، اضبط مرشحات الانبعاث ، والمرشحات المقطوعة ، ل ECFP والسترين. بعد ذلك ، قم ببرمجة قارئ اللوحة لقياس الانبعاثات كل أربع ثوان ، ليصبح المجموع 180 ثانية.

اختر خيارات حجم لوحة microleader 100 ، وارتفاع ماصة 150 ميكرولتر ، وتوصيل 50 لترا صغيرا من الدواء من اللوحة المركبة ثلاثية الأضعاف. اضبط النقطة الزمنية لتوصيل الدواء على 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط من الصفين A و B ، وأضف 100 ميكرولتر من ACSF إلى لوحة شم البئر 96 ، أي حوالي 90٪ ملتقية.

بعد ذلك ، قم بتحميل لوحة الدواء ثلاثية الأضعاف ولوحة شم 96 جيدا في قارئ اللوحة. اترك 30 دقيقة لموازنة الألواح عند 37 درجة مئوية ، قبل بدء البرنامج. بعد تشغيل قارئ اللوحة، قم بتصدير قيم قارئ التألق إلى ملف نصي.

بعد ذلك ، قم باستيراد هذا الملف إلى قالب جدول بيانات تم إنشاؤه مسبقا يعمل على تطبيع شدة الإزهار إلى خطوط الأساس قبل التحفيز ، ويحسب نسبة الذروة لكل تركيز ناهض ، ويولد منحنى استجابة الجرعة. قم بإعداد ماصة حقن CNiFER عن طريق وضع شعرية زجاجية على مجتذب قطب كهربائي عمودي. استخدم زوجا من الملقط لكسر طرف القطب إلى قطر 40 ميكرومتر تقريبا.

ضع إسفنجة مبللة ب ACSF على نافذة جمجمة بسمك اثنين في ثلاثة ملليمترات من فأر مخدر ، للحفاظ على رطوبتها أثناء تحضير الخلايا للحقن. بعد ذلك ، قم بحصاد استنساخ CNiFER الذي تم زراعته في قارورة T-75 إلى حوالي 80٪ من التقاء. استنشق الوسائط ، واغسل الخلايا باستخدام PBS المعقم.

قم بإزالة PBS ، واستخدم 10 ملليلتر من ACFS لإخراج الخلايا من قاع القارورة. ثم قم بتقطيع الخلايا لفصل كتل الخلايا. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي لزراعة الخلايا.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من ACSF. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 1400 مرة G ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وترك الحبيبات ، مغطاة ب ACSF. بعد ذلك، املأ ماصة الحقن بالزيت المعدني.

قم بتحميل الماصة على حاقن نانو. ضع خمسة ميكرولترات من تعليق خلية CNiFER على شريط من فيلم البارافين البلاستيكي بالقرب من مستحضر الماوس. ارسم خلايا CNiFER في الماصة المسحوبة.

الآن ، حرك الماصة إلى إحداثيتين x و y المستهدفة. اخفض الماصات واثقب الجمجمة الرقيقة المعدة مسبقا. استمر في حوالي 200 إلى 400 ميكرومتر تحت سطح الجمجمة ، في الطبقتين الثانية والثالثة من القشرة.

حقن 4.6 نانولتر من خلايا CNiFER في أعمق موقع باستخدام حاقن النانو. لاحظ الحركة في واجهة الزيت والخلية. وبعد ذلك ، انتظر لمدة خمس دقائق حتى يتم توزيع الخلايا.

اسحب الماصة حوالي 100 ميكرومتر وحقن 4.6 نانولتر أخرى من خلايا CNiFER وانتظر مرة أخرى خمس دقائق. بعد ذلك ، اسحب الماصة ببطء ورفق لمنع التدفق العكسي ل CNiFERs. في هذا الإجراء ، ضع منصة التصوير مع الماوس المقيد بالرأس تحت هدف الغمر في الماء 10x في مجهر تصوير الفوتونين.

أدخل مكعب المرشح لتصوير الحنق الذي يحتوي على مرآة ثنائية اللون عند 505 نانومتر ومرشحات تمرير النطاق التي تمتد من 460 نانومتر إلى 500 نانومتر لقياس ECFP و 520 نانومتر إلى 560 نانومتر لقياس السترين. بعد ذلك ، أضف ACSF إلى البئر ، الذي يحتوي على نافذة الجمجمة الرقيقة وقم بخفض هدف الغمر في الماء 10x في ACSF. استخدم قطعة العين جنبا إلى جنب مع مصباح الزئبق ومكعب مرشح GFP لتحديد موقع CNiFERs.

الآن ، قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء 40x. بعد ذلك ، حدد مسار الضوء المناسب لتصوير الفوتونين. قم بتشغيل ليزر النبض القريب من الأشعة تحت الحمراء فيمتو ثانية.

حدد الطول الموجي 820 نانومتر ، وإعداد الطاقة من خمسة إلى 15٪ اضبط جهد pmt واحد و pmt اثنين على قيمة دون الحد الأقصى ، عادة 500-1000 فولت ، اعتمادا على pmt. بعد ذلك ، قم بتعيين الكسب إلى واحد لكل قناة ، وصفر الموضع z للهدف. اخفض الهدف حوالي 100 إلى 200 ميكرومتر من السطح القشري ، وابدأ فحص xy.

اضبط طاقة الليزر والكسب وجهد pmt لكل قناة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإزهار CNiFER. بعد ذلك ، استخدم البرنامج لتقييد التصوير بمنطقة تحتوي على خلايا CNiFER ، بالإضافة إلى منطقة الخلفية. حدد خط راعي البقر ، بمتوسط اثنين ، للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة ، واستخدم معدل مسح من 3 إلى هرتز واحد بأربعة ميكروثانية لكل بكسل.

بعد ذلك ، ارسم عائد استثمار حول خلايا CNiFER. يحيط بحوالي ثلاث إلى أربع خلايا لكل مستوى. قم بإعداد تحليل في الوقت الفعلي لمتوسط شدة عائد الاستثمار.

بعد ذلك ، ابدأ في الاستحواذ لمراقبة إزهار CNiFER بمرور الوقت وابدأ التحفيز الكهربائي أو التجربة السلوكية ، أثناء مراقبة الحنق. في هذا المثال ، تم قياس استجابة الحنق D2R CNiFER على قارئ لوحة بنظام توصيل الحل. يوضح هذا الرسم البياني استجابة الحنق أثناء تطبيق الدوبامين على D2 CNiFERs.

لاحظ أن انبعاثات ECFP تنخفض بينما يزداد انبعاث السترين مع الدوبامين. وهنا مخطط لنسبة الحنق المقابلة. تظهر هنا منحنيات استجابة الجرعة لاستجابة D2 CNiFERs للدوبامين والنورادرينالين.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم CNiFERs للتحكم المستجيب التي تفتقر إلى D2R. يوضح هذا الرسم البياني الشريطي استجابة نسبة الحنق للناقلات العصبية والمغيرات الأخرى عند 50 نانو مولار وضرس صغير واحد. هنا ، يؤدي التحفيز الكهربائي للخلايا العصبية DA في المادة السوداء ، إلى حدوث تغيير كبير في نسبة الحنق ل D2 CNiFERs.

لاحظ كيف تزداد سعة الاستجابة مع زيادة شدة التحفيز الكهربائي. يزيد تحفيز الاقتران مع حقن الكوكايين من استجابة CNiFER. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء CNiFERs واختبارها واستخدامها للتصوير في الجسم الحي.

طوال فترة تطوير CNiFERS ، من الضروري الحفاظ على تقنية معقمة ، لأن هذه الخلايا سيتم زرعها في النهاية في الفئران الحية. يوفر تحقيق CNiFERs أداة مهمة للأبحاث في مجال علم الأعصاب لقياس إطلاق أي ناقل عصبي ، أو معدل عصبي ، يشير بصريا من خلال مستقبلات مقترنة ببروتين G. شكرا لك على المشاهدة ، ونتمنى لك السعادة في تجاربك.