تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحديد تكرار السترومولات باستخدام المجهر الفلوري البؤري للخلايا الحية داخل الأوراق، وتصور السترومولات في المختبر باستخدام البلاستيدات الخضراء المستخلصة من الأوراق. يمكن لهذه الطرق التجريبية أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا الخلية النباتية وأبحاث البلاستيدات الخضراء من خلال اكتشاف كيفية عمل السترومولات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنيات في أنها تنتج بيانات قابلة للتكرار وقوية، حتى بالنسبة لهذه التراكيب الديناميكية للغاية في البلاستيدات الخضراء.

جاءت فكرة دراسة عزل البلاستيدات الخضراء لأن بعض الأبحاث أشارت إلى أن تكوين الستومولات (stromules) يتطلب وجود بنى سيتوبلازمية، مثل الهيكل الخلوي، لكي تتشكل. لذا، قررنا خلط الخلية ومعرفة ما إذا كان بإمكان الستومولات أن تتشكل رغم ذلك. ولتحضير عينات الأوراق، ابدأ باستخدام شفرة حلاقة حادة جداً لقطع جزء صغير من ورقة نبات *Nicotiana benthamiana*.

مباشرة بعد قطع مقطع الورقة، اغمره في سرنجة سعة 5 mL مملوءة بالماء. بعد ذلك، قم بتفريغ الهواء من السرنجة، ثم طبق فراغاً عن طريق سد فتحة السرنجة بإصبعك قبل سحب المكبس. حرر المكبس برفق لتجنب إتلاف مقطع الورقة.

ثم كرر عملية إزالة الهواء مرتين أو ثلاث مرات، أو حتى تتم إزالة الهواء وتظهر الورقة بلون أخضر داكن. أضف قطرة من الماء إلى شريحة مجهرية، وضع مقطع الورقة فوق القطرة. ثم أضف قطرة أخرى من الماء فوق الورقة، وضع غطاء الشريحة.

إذا وجدت أي فقاعات هوائية، فقم بالنقر بلطف على غطاء الشريحة حتى يتم إزالتها. باستخدام الضوء النافذ وعدسة شيئية بقوة 20x، ركز على مجال رؤية بالقرب من مركز مقطع الورقة، بحيث تظهر عدة بلاستيدات خضراء في آن واحد. احفظ صورة بالضوء النافذ، لتمكين تمييز أنواع الخلايا لاحقاً إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، انتقل إلى الإضاءة بالليزر مع استخدام مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة للفلوروفور المستخدم، واحفظ صورة أخرى. باستخدام برنامج المجهر، اختر قناة GFP، وانقر لضبط فتحة الثقب (pinhole) لتكون وحدة هوائية واحدة (one airy unit). اختر المسح بالليزر لبدء معاينة العينة، ثم انقر فوق قناة GFP وكسب الكاشف (detector gain) لتقليل قدرة الليزر مع الاستمرار في رؤية السترو مولات (stromules) بوضوح.

بعد ذلك، قم بإعداد تجربة مكدس Z (Z stack) لجمع سلسلة من الصور عبر بشرة الورقة في مجال الرؤية. اضبط سرعة المسح ودقة الصورة حسب الضرورة لضمان جمع مكدس Z بسرعة. ثم احفظ مكدس Z للتحليل لاحقاً.

باستخدام برنامج image J، قم بدمج مجموعة صور Z stack في صورة واحدة باستخدام أقصى كثافة (maximum intensity) في البرنامج. ثم حدد وقم بتعداد جميع البلاستيدات الخضراء في الصورة يدويًا. وبالنسبة لكل بلاستيدة خضراء، حدد بصريًا ما إذا كان هناك سترومول (stromule) واحد أو أكثر يمتد من البلاستيدة الخضراء في صورة Z stack المدمجة.

لاستخلاص البلاستيدات الخضراء السليمة، قم بتحضير محلول استخلاص مؤقت بارد باستخدام الكواشف التالية. بعد ذلك، استخدم NaOH و HCl لضبط الرقم الهيدروجيني (pH) إلى 6.9، ثم احفظه في الثلاجة قبل الاستخدام. قم بتحضير محلول عزل، واضبط الرقم الهيدروجيني (pH) إلى 7.6.

إذا كانت الأوراق لا تعبر عن صبغة فلورية سديمية (stromofluorophore) مشفرة جينياً، فقم بتحضير محلول كربوكسي فلوريسئين ثنائي الأسيتات (Carboxyfluorescein diacetate)، أو محلول CFDA. ولعزل البلاستيدات الخضراء، قم بإزالة ما يقارب 5 إلى 10 جرامات من الأوراق من عدة نباتات واشطفها سريعاً بالماء البارد. ثم انقل الأوراق فوراً إلى 50 ملليلتر من منظم استخلاص بارد.

باستخدام خلاط كهربائي مع عدة نبضات قصيرة، اطحن الأوراق، ثم قم بترشيح الخليط عبر طبقتين إلى ثلاث طبقات من الشاش لإزالة بقايا الأوراق. قسّم البلاستيدات الخضراء المستخلصة إلى أنبوبي طرد مركزي سعة كل منهما 50 milliliter، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 750 x g. تخلص من الراشح، واستخدم 10 milliters من محلول العزل لإعادة تعليق البلاستيدات الخضراء.

ثم يتم إجراء الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 750 x g، مع التخلص من الطافي، واستخدام محلول العزل لإعادة تعليق البلاستيدات الخضراء حتى يصل الحجم النهائي إلى خمسة ملليلترات. إذا كانت البلاستيدات الخضراء مستخلصة من نباتات معدلة وراثياً تعبّر عن بروتينات فلورية مستهدفة للبلاستيدات، يتم نقل 20 µL من البلاستيدات الخضراء إلى شريحة مجهرية وإضافة غطاء الشريحة. ثم يتم إجراء الفحص المجهري.

لصبغ البلاستيدات الخضراء في النباتات التي لا تعبر عن بروتينات فلورية مستهدفة للبلاستيدات، أضف 5 µL من مخزون CFDA بتركيز 50 mM إلى 5 mL من البلاستيدات الخضراء في محلول العزل. بعد ترك البلاستيدات الخضراء لتحضن لمدة 5 دقائق، انقل كمية صغيرة إلى شريحة، وأضف غطاء الشريحة ثم ابدأ في الفحص المجهري. وأخيرًا، استخدم مجموعة مرشحات FITC أو GFP وعدسة شيئية 20x لتصوير بلاستيدات خضراء متعددة في وقت واحد.

أو عدسة شيئية ذات تكبير أعلى لتصوير بلاستيدة خضراء واحدة معزولة. تظهر هنا مجموعة مدمجة توضح تردد الثغور التي تظهر فيها GFP في سويقات شتلات N.Benthamiana الصغيرة. في هذه اللوحة، تم تقليل تشبع الصورة وعكس ألوانها بحيث تظهر السدى باللون الأسود.

تم تصنيف البلاستيدات الخضراء إما بأنها تفتقر إلى الخيوط السيتوبلازمية (stromules)، أو بأنها تمتلك خيطاً واحداً على الأقل. ومن بين 87 بلاستيدة خضراء بشرية تم فحصها، تبين أن 33 منها تمتلك خيوطاً سيتوبلازمية، وبذلك بلغت نسبة تكرارها 37.9% في هذه الورقة. يمثل هذا الرسم البياني تحليل أكثر من 23,000 بلاستيدة خضراء، ومئات الخلايا من ورقة واحدة مأخوذة من 21 نباتاً مختلفاً.

بلغ متوسط تكرار السترومولات (stromules) خلال النهار 20.8 ± 1.8%، بينما بلغ متوسط تكرارها خلال الليل 12.8 ± 0.9%، مما يشير إلى تكرار أعلى بكثير خلال النهار، وفقاً لما حدده اختبار Welch's T test. في هذا الشكل، لوحظت سترومولات البلاستيدات الخضراء في المختبر بعد عزلها من نبات N.benthamiana الذي يعبّر عن GFP المستهدف للبلاستيدات، أو بعد استخدام CFDA لصبغ البلاستيدات الخضراء من نبات N.benthamiana أو Spinachia oleracea. عند إجراء التصوير الحي للخلايا لرصد السترومولات، من المهم العمل بسرعة، والتقليل من التعامل مع أنسجة النبات قدر الإمكان.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل إسكات الجينات أو المعالجات الكيميائية لاكتشاف جزيئات إضافية أو مسارات أخرى مشاركة في تكوين الستيرومولات ووظيفتها. وقد استخدم الباحثون في بيولوجيا الخلية النباتية والمناعة النباتية هذه التقنية لدراسة دور الستيرومولات في مسارات الإشارات الخلوية واستجابات النبات لمسببات الأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حساب تواتر الستيرومولات في الورقة، وكيفية ملاحظة الستيرومولات في البلاستيدات الخضراء المستخلصة.

وتذكر أن الليزرات والجهد الكهربائي الذي يغذي المجهر البؤري الماسح بالإلكترونات يمكن أن تكون خطيرة للغاية، ومن المهم فهم متطلبات النظام لاستخدام هذا الجهاز.