تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحديد تردد اللحمة باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للخلايا الحية داخل الأوراق ، وتصور السترومول في المختبر باستخدام البلاستيدات الخضراء المستخرجة من الأوراق. يمكن أن تساعد هذه الطرق التجريبية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلايا النباتية وأبحاث البلاستيدات الخضراء من خلال اكتشاف كيفية عمل اللحوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تنتج بيانات قابلة للتكرار وقوية ، حتى من هياكل البلاستيدات الخضراء عالية الدينامية.

كانت لدينا فكرة دراسة عزل البلاستيدات الخضراء لأن بعض الأبحاث أشارت إلى أن تكوين اللحمة يتطلب هياكل العصارة الخلوية ، مثل الهيكل الخلوي ، لتكون. لذلك قررنا مزج الخلية ، ومعرفة ما إذا كان لا يزال من الممكن أن تتشكل. لتحضير عينات الأوراق ، ابدأ باستخدام شفرة حلاقة حادة جدا لقطع جزء صغير من ورقة Nicotiana benthamiana.

مباشرة بعد قطع قسم الورقة ، اغمرها في حقنة سعة خمسة ملليلتر مملوءة بالماء. ثم قم بإزالة الهواء من المحقنة ، وقم بتطبيق مكنسة كهربائية باستخدام إصبع لتغطية فتحة المحقنة ، قبل سحب المكبس. حرر المكبس برفق لتجنب إتلاف قسم الأوراق.

ثم كرر إزالة الهواء مرتين أو ثلاث مرات ، أو حتى تتم إزالة الهواء ، وتبدو الورقة خضراء عميقة. أضف قطرة ماء إلى شريحة ، وضع قسم الأوراق على القطرة. ثم أضف قطرة أخرى من الماء إلى أعلى الورقة ، وأضف زلة غطاء.

إذا كانت هناك أي فقاعات هواء ، فاضغط برفق على زلة الغطاء حتى يتم إزالتها. مع الضوء المنقول ، وهدف 20x ، ركز على مجال رؤية بالقرب من مركز قسم الورقة ، وتصور البلاستيدات الخضراء المتعددة في وقت واحد. احفظ صورة بالضوء المنقول، بحيث يمكن تمييز أنواع الخلايا لاحقا إذا لزم الأمر.

ثم قم بالتبديل إلى إضاءة الليزر باستخدام مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة للفلوروفور المستخدم ، واحفظ صورة أخرى. باستخدام برنامج المجهر ، حدد قناة GFP ، وانقر لضبط فتحة الثقب على وحدة واحدة جيدة التهوية. حدد المسح الضوئي بالليزر لبدء تصور العينة ، ثم انقر فوق قناة GFP وكسب الكاشف لتقليل طاقة الليزر مع الاستمرار في تصور اللحمات بوضوح.

بعد ذلك ، قم بإعداد تجربة مكدس Z التي ستجمع سلسلة الصور من خلال بشرة الأوراق في مجال الرؤية. اضبط سرعة المسح الضوئي ودقة الصورة حسب الضرورة للتأكد من جمع مكدس Z بسرعة. ثم احفظ مكدس Z لتحليله لاحقا.

باستخدام الصورة J، قم بدمج مكدس Z في صورة واحدة باستخدام الحد الأقصى للكثافة في البرنامج. ثم حدد وعد جميع البلاستيدات الخضراء في الصورة يدويا. لكل بلاستيدات خضراء ، حدد بصريا ما إذا كان هناك سخرية واحدة أو أكثر تمتد من البلاستيدات الخضراء في صورة مكدس Z المدمجة.

لاستخراج البلاستيدات الخضراء السليمة ، قم بإعداد مخزن مؤقت للاستخراج على البارد باستخدام الكواشف التالية. ثم ، باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.9 ، ثم ضعه في الثلاجة قبل الاستخدام. قم بإعداد المخزن المؤقت للعزل ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6.

إذا كانت الأوراق لا تعبر عن سترومفلوروفور مشفر وراثيا ، فقم بإعداد محلول ثنائي الأسيتات Carboxyfluorescein أو CFDA. لعزل البلاستيدات الخضراء ، قم بإزالة ما يقرب من 5 إلى 10 جرامات من الأوراق من عدة نباتات واشطفها لفترة وجيزة بالماء البارد. ثم انقل الأوراق على الفور إلى 50 مل من محلول الاستخلاص البارد.

باستخدام الخلاط مع عدة نبضات قصيرة ، قم بطحن الأوراق ، ثم قم بتصفية الخليط من خلال طبقتين إلى ثلاث طبقات من قماش الجبن لإزالة بقايا الأوراق. قسم البلاستيدات الخضراء المستخرجة إلى أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 750 × جم. تخلص من المادة الطافية ، واستخدم 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل لإعادة تعليق البلاستيدات الخضراء الخضراء.

ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 750 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، واستخدم عازلة العزل لإعادة تعليق البلاستيدات الخضراء حتى الحجم النهائي البالغ خمسة ملليلتر. إذا كانت البلاستيدات الخضراء من نباتات معدلة وراثيا تعبر عن بروتينات الفلورسنت المستهدفة بالبلاستيد ، فقم بنقل 20 ميكرولترا من البلاستيدات الخضراء إلى شريحة وأضف زلة غطاء. ثم إجراء الفحص المجهري.

لتلطيخ البلاستيدات الخضراء من النباتات التي لا تعبر عن بروتينات الفلورسنت المستهدفة بالبلاستيد ، أضف خمسة ميكرولترات من مخزون CFDA 50 ملليمولار إلى خمسة ملليلتر من البلاستيدات الخضراء في المخزن المؤقت للعزلة. بعد السماح للبلاستيدات الخضراء بالحضانة لمدة خمس دقائق ، قم بنقل كمية صغيرة إلى شريحة ، وأضف زلة غطاء وقم بإجراء الفحص المجهري. أخيرا ، استخدم مجموعة مرشحات FITC أو GFP وهدف 20x لتصور البلاستيدات الخضراء المتعددة في وقت واحد.

أو هدف أعلى لتصور بلاستيدات خضراء معزولة واحدة. يظهر هنا كومة مدمجة تظهر تردد فغر GFP في تداعية شتلات N.Benthamiana الصغيرة. في هذه اللوحة ، تم إزالة التشبع من الصورة وقلبها بحيث تظهر السدى باللون الأسود.

تم تصنيف البلاستيدات الخضراء إما على أنها لا تحتوي على سترومولات ، أو تحتوي على سدى واحد على الأقل. من بين 87 بلاستيدات خضراء للبشرة تم تصورها ، تحتوي 33 على سترومول ، بتردد 37.9 في المائة في هذه الورقة. يمثل هذا الرسم البياني تحليل أكثر من 23,000 بلاستيدات خضراء ، وعدة مئات من الخلايا من ورقة واحدة من 21 نباتا مختلفا.

متوسط تردد اللحمة خلال النهار 20.8 زائد أو ناقص 1.8 في المائة ، وكان متوسط تردد اللحمة الليلية 12.8 زائد أو ناقص 0.9 في المائة ، مما يشير إلى تردد أعلى بكثير أثناء النهار ، على النحو الذي حدده اختبار Welch's T. في هذا الشكل ، لوحظت سترومولات البلاستيدات الخضراء في المختبر بعد عزل N.benthamiana التي تعبر عن GFP المستهدف بالبلاستيدات ، أو بعد استخدام CFDA لتلطيخ البلاستيدات الخضراء من N.benthamiana ، أو Spinachia oleracea. أثناء إجراء تصوير الخلايا الحية للسدوم، من المهم العمل بسرعة، ومعالجة الأنسجة النباتية بأقل قدر ممكن.

بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل إسكات الجينات أو العلاجات الكيميائية لاكتشاف لاعبين جزيئيين إضافيين أو مسارات تشارك في تكوين اللحمة ووظيفتها. تم استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين في بيولوجيا الخلايا النباتية ومناعة النبات لدراسة دور اللحمات في مسارات الإشارات الخلوية واستجابات النبات لمسببات الأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حساب تردد اللحمة في الورقة ، وكيفية مراقبة اللحمات في البلاستيدات الخضراء المستخرجة.

وتذكر أن الليزر والجهد الكهربائي الذي يزود المجهر متحد البؤر الإلكتروني الماسح يمكن أن يكونا خطيرين للغاية ، ومن المهم فهم متطلبات النظام لاستخدام هذا الجهاز.