إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الهيكل ، مثل تحضير البروتينات الحساسة ، حيث تتوفر كمية محدودة من البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه بالمقارنة مع طرق تحضير العينات القياسية ، لا يلزم سوى كميات دقيقة من العينة ، وأنه لا توجد خطوة قاسية لنشاف الورق. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحليل الخلية المفردة عن طريق البروتينات البصرية ، أو تشخيص الأمراض المرتبطة بالبروتين.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كانت لدينا التكنولوجيا المتاحة لحل الهياكل عالية الدقة مع حوالي 100،000 جسيم فردي فقط. للبدء ، قم بإعداد العينة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، قم بتجميع كوب الإيثان وحامل صندوق التبريد والعنكبوت.

واملأ وعاء التبريد حتى أسنانه بالنيتروجين السائل. بعد بضع دقائق ، سيكون الكوب باردا وخاليا من النيتروجين السائل. ثم افتح زجاجة غاز الإيثان ، واترك الغاز يتدفق ببطء إلى كوب الإيثان.

دع الكوب يمتلئ بالإيثان السائل حتى يصبح المستوى أقل من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات. سيستغرق ذلك بضع دقائق ويتطلب حوالي خمسة ملليلتر من الإيثان السائل. قم بإزالة العنكبوت ، ضع غطاء البوليستيرول في الأعلى ، وضع حاوية التبريد على الحامل في كاتب التبريد.

أمسك شبكة EM المتوهجة المفرغة باستخدام ملاقط كاتب التبريد ، وقم بربط الملقط على المغناطيس الكهربائي ، وقم بربط الملاعب الدقيقة لمحاذاة الشبكة بشكل مسطح على المسرح ، وجانب فيلم الكربون لأعلى. مرة أخرى في البرنامج ، انقر نقرا مزدوجا فوق grid_save. ثم اضبط موضع الشعيرات الدموية الدقيقة ، بحيث يكون الطرف حوالي 10 ميكرومتر فوق سطح الشبكة.

تأكد من أن الشعيرات الدموية الدقيقة يمكن أن تتحرك بحرية عبر الشبكة ، دون لمسها في أي مكان. وإذا لزم الأمر ، اسحب الشعيرات الدموية الدقيقة بضعة ميكرومترات. ثم قم بإعادته إلى موضعه مرة أخرى إلى مركز الشبكة ، واحفظ الموضع الجديد كشبكة.

انقل الشعيرات الدموية الدقيقة إلى وضع المنزل. بعد ذلك ، اغسل الشعيرات الدموية الدقيقة ببضع عشرات من النانولترات من سائل النظام ، واستخدم أنسجة خالية من النسالة لإزالة أي قطرات من الشعيرات الدموية الدقيقة. مع إعداد كل شيء الآن ، ابدأ البرنامج النصي للماكرو.

يتحرك الماكرو أولا إلى موضعه ، ويوزع خمسة نانولترات من سائل النظام لإزالة أي فقاعات هواء عند الحافة ، ثم ينتقل إلى موضع العينات. بعد ذلك ، يستنشق 65 نانولترا من العينة ، ثم ينقع خمسة نانولترات مرة أخرى في أنبوب العينة. هذا يفسر رد فعل النظام العكسي ، ويسمح بالكتابة المتزامنة.

بعد أن ينتقل إلى موضع الشبكة ، يبدأ نمط الكتابة ، مما يؤدي إلى تحرك الشعيرات الدموية الدقيقة عبر الشبكة وتوزيع 45 نانولترا من العينة في نفس الوقت. ثم ينقل الشعيرات الدموية الدقيقة مرة أخرى إلى مركز الشبكة ، ويخفضها بمقدار 10 ميكرومتر أخرى ، ويسحب سائل العينة الزائد. أخيرا ، يسحب الماكرو الشعيرات الدموية الدقيقة ويقوم بإيقاف تشغيل المغناطيس الكهربائي ، مما يؤدي إلى بدء آلية تجميد الغاطس.

بمجرد تحريره من المغناطيس ، حرر المحول المغناطيسي بعناية من المكبس وانقل الشبكة بسرعة من كوب الإيثان إلى حاوية التبريد ، التي تحتوي على صندوق التبريد ، ووضع الشبكة في فتحة حرة. للبدء ، قم بإعداد الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، وقم بتركيب شريحة أكسيد قصدير الإنديوم على ملحق المجهر. استخدم اثنين من المسمارين لتثبيت الشريحة على ملحق الألومنيوم ، ولضمان التلامس الكهربائي بين طلاء أكسيد القصدير الإنديوم للشريحة وإطار الألمنيوم المؤرض كهربائيا.

ثم قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من البئر ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. بعد الغسيل الأخير ، احتفظ بالخلايا في مخزن التثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، ضع ملحق الألومنيوم الذي يحمل شريحة أكسيد قصدير الإنديوم في مرحلة حاضنة الخلية الحية ، على الإعداد.

باستخدام المجهر ، حدد موقع مزرعة الخلايا واختر منطقة خالية من الخلايا. اقترب من طرف الشعيرات الدموية الدقيقة على سطح الشريحة ولمسه برفق. ثم اسحب الطرف في 100 ميكرومتر واحفظ الموضع كخلايا.

الآن اترك بسرعة مزرعة الخلية واغسل الطرف الشعري الدقيق ببضع عشرات من النانولترات من سائل النظام ، ثم ضعه في مزرعة الخلية مرة أخرى. قم بتوزيع بضعة نانولترات أثناء الغمر في بئر PDMS لضمان عدم احتجاز فقاعات الهواء عند الحافة. انقر نقرا مزدوجا في موضع الخلية واقترب برفق من سطح شريحة أكسيد قصدير الإنديوم وعند ملامسته ، اسحب الطرف 10 ميكرومتر.

في هذه المرحلة ، حدد خلية قريبة للتحلل. وضع طرف الشعيرات الدموية الدقيقة فوق الخلية المستهدفة. ثم ابدأ البرنامج النصي للماكرو لتحلل الخلية الواحدة.

بمجرد البدء ، سيطلب البرنامج النصي موضعا يجب نقل الشعيرات الدموية الدقيقة إليه بعد تحلل الخلية بنجاح. أدخل الموضع المطلوب ، على سبيل المثال الشبكة ، لشبكة EM. سيستمر الماكرو بعد ذلك دون تدخل المستخدم ، وسيبدأ بتحريك مرحلة المجهر في زراعة الخلايا 100 ميكرومتر إلى اليسار ، حيث يأخذ لقطة للخلية المستهدفة.

ثم يتم توزيع 15 نانولترا من الماء المقطر المزدوج من الأنبوب الشعري الدقيق ، مما يؤدي إلى إزاحة وتخفيف المخزن المؤقت عالي الملح ، وتطبيق الضغط الاسموزي على الخلية. بعد ذلك ، تتحرك المرحلة مرة أخرى لوضع الطرف فوق الخلية المستهدفة مرة أخرى. هناك ، يتم تطبيق انفجار جهد محدد مسبقا ، وبعد 500 مللي ثانية ، يبدأ نظام المضخة في شفط ثلاثة نانولترات من العينة بمعدل تدفق ميكرولتر في الدقيقة.

أخيرا ، تنتقل المرحلة إلى اليسار مرة أخرى ، مما يسمح بفحص الخلية. تظهر نافذة تطلب إدخال المستخدم. إذا نجحت الخلية، أدخل نعم لالتقاط لقطة للخلية التي تم تحللها.

بعد ذلك ، تنتقل الشعيرات الدموية الدقيقة إلى موقع endo ، مغمورة في سائل الخزان. اترك الشعيرات الدموية مغمورة لمدة ثماني إلى 12 دقيقة ، اعتمادا على هندسة الفوهة. بعد ذلك ، قم بتوزيع خمسة نانولترات من محللة الخلية المكيفة على الشبكة.

اسحب الشعيرات الدموية الدقيقة واترك العينة المكيفة تجف ببطء على مرحلة نقطة الندى. أخيرا ، قم بإزالة الشبكة من المسرح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في صندوق شبكي. تظهر هنا صور التبريد النموذجية للعينات المجمدة باستخدام إعداد CryoWriter الموصوف.

في نظرة عامة على الشبكة ، يمكن رؤية محيط الجليد الزجاجي بوضوح. عند الفحص الدقيق لفتحة الشبكة مع فيلم الكربون المثقوب الذي يحتوي على جليد زجاجي ، يمكن العثور على ثقوب بيضاء ، مما يشير إلى أنه لم تكن جميع الثقوب مملوءة بعازلة العينة. في إحدى العينات التي تحتوي على ثقوب كربونية ، يمكن رؤية ذيل العاثية بوضوح بالتفصيل.

باستخدام CryoWriter الذي تم إعداده لأداء البروتينات البصرية أحادية الخلية ، يمكن للمرء أن يرى أشياء مثل البروتينات الفردية ، على سبيل المثال الأكتين الخيطي وبقع الغشاء مع البروتينات المرفقة. الصورة التي يمكنك رؤيتها في اللوحة 6 ب ملطخة سلبا بصبغة سلبية بنسبة 2٪ ، بناء على مركب التنغستن العضوي. تظهر اللوحة c محللة أحادية الخلية معدة ل cryo EM. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير البقع السلبية أو شبكات التبريد EM ، من الأحجام الإجمالية للنانولتر من عينات البروتين أو المستخلصات أحادية الخلية.

لا تنس أن العمل باستخدام الإيثان السائل والنيتروجين يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء نظارات السلامة ومعطف المختبر ، من خلال تنفيذ هذا الإجراء.