الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم فاعلية الأدوية المعدلة للمناعة باستخدام عداد الخلايا الآلي عن طريق قياس تكوين الخلايا الليمفاوية التائية أو تحول الانفجار. يوفر هذا الاختبار طريقة سريعة لقياس تنشيط الخلايا الليمفاوية التائية باستخدام عداد خلوي آلي مجهز لقياس أقطار الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس السريع والبسيط والمباشر من الخلايا المفردة ، على عكس فحوصات تكاثر الخلايا الليمفاوية التائية الشائعة.

سيؤدي علاج الخلايا الليمفاوية بالأدوية المعدلة للمناعة إما إلى زيادة أو تقليل معدل ومدى تكوين الأريمة الخلوية. باستخدام مقايسة عداد الخلية ، يمكن قياس مدى تكوين الأريمة هذا في حوالي أربع دقائق لكل عينة. في غضون عشر دقائق من التضحية ، رش بطن الفأر بنسبة 70 في المائة من الإيثانول واستخدم المقص لعمل شق في الفراء والجلد على الجانب الأيسر من.

امسك الجلد بعيدا عن الظهر للكشف عن الصفاق. ثم ضع الكلورهيكسيدين بنسبة أربعة بالمائة على موقع الشق. باستخدام مجموعة ثانية من المقص والملقط ، قم بعمل قطع من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات على طول وسط البطن لفتح الصفاق.

بعد ذلك ، قم بإزالة المرفقات الحشوية والدهون الزائدة المحيطة بالطحال ونقل الأنسجة إلى وعاء من DPBS. بعد ذلك ، أضف عشرة ملليلترات من RPMI 1640 الكامل المتوسط إلى طبق استزراع يبلغ طوله عشرة سنتيمترات وسحق الطحال بين شريحتين زجاجيتين بلوريتين معقمين. قم بتصفية ملاط الأنسجة من خلال مصفاة خلية نايلون معقمة 40 ميكرون في طبق ثقافة جديد يبلغ طوله عشرة سنتيمترات لإزالة الأنسجة الضامة والحطام ونقل معلق الخلية المفردة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء. بعد عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف ، اجمع الخلايا باستخدام طرد مركزي آخر وأعد تعليق الحبيبات في عشرة ملليلتر من الوسط الطازج. بعد ذلك الطرد المركزي الخلايا ثانية لإعادة التعليق في اثنان ملليلتر من 37 درجة مئوية وسط كامل.

لتنقية الخلايا التائية ، اغسل أولا عمودا أو عمودين من صوف النايلون لكل طحال مرتين بخمسة ملليلتر من RPMI الكامل وضع الأعمدة في حاضنة ثقافة خلايا ثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، قم بتحميل ملليلترين من معلق خلايا الطحال المعزول في الجزء العلوي من كل عمود واسمح للخلايا بالمرور عبر العمود حتى يصل السائل إلى الجزء العلوي من الصوف. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من الوسط الكامل الطازج 37 درجة مئوية إلى أعلى الأعمدة واترك الوسط يمر عبر صوف النايلون حتى يصل السائل الموجود في الجزء العلوي من العمود إلى أعلى الصوف.

الآن قم بتغطية الصوف بثلاثة ملليلتر من 37 درجة مئوية متوسطة كاملة وأعد العمود إلى حاضنة زراعة الخلية إلى جميع الخلايا البائية والخلايا الليفية والخلايا الملحقة للالتصاق بألياف الصوف. بعد ساعة ، في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر ، اغسل العمود مرتين بخمسة ملليلتر من الوسط الكامل الطازج لإزالة الخلايا التائية غير الملتصقة. ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد غسل الخلايا التائية مرة واحدة بعشرة ملليلتر من الوسط الكامل ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من الوسط الكامل الطازج. ثم عد الخلايا وقم بتخفيف المعلق إلى 0.5 في عشرة إلى ست خلايا لكل تركيز مليلتر في وسط كامل طازج للبذر في صفيحة ثقافة خلية مكونة من ستة أو 24 بئرا حسب الاقتضاء تجريبيا. في غضون 24 ساعة من عزلها ، قم بتنشيط عمود صوف النايلون المعزول للخلايا التائية مع الحافز المناسب والدواء التجريبي ذي الأهمية.

بعد 12 إلى 72 ساعة، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لخلط الخلايا المعالجة المنشطة برفق لإزالة أي كتل. لقياس أقطار الخلية بواسطة عداد الخلايا الآلي ، قم بنقل مليلتر واحد من الخلايا المعالجة من كل بئر إلى أكواب عينات فردية وضع أكواب العينة في دائري العينة لعداد الخلية الآلي. أدخل معرف العينة ومعلومات نوع الخلية لتسجيل العينات وبدء تشغيل العينات.

بعد خلط التريبان الأزرق مع تعليق الخلية ، يتم تمرير الخلايا فوق حقل التصوير حتى يتم جمع حوالي 100 صورة خلية من كل عينة. يرسم البرنامج دائرة حول كل خلية مكتشفة ملطخة باللون الأزرق وغير ملوثة لتحديد قطر الخلية. عند قياس جميع الخلايا ، يتم تصدير البيانات إلى جدول بيانات يعرض النتائج على أنها إجمالي عدد الخلايا القابل للتطبيق لكل قطر مقاس.

يمكن بعد ذلك تقديم البيانات على شكل رسوم بيانية. بعد يومين من التحفيز باستخدام PMA والأيونومايسين ، لوحظ تحول كبير في متوسط توزيع التردد نحو أقطار أكبر للخلايا مع تقليل عدد الخلايا التائية بأقطار أصغر وفقا لذلك. عند تركيز الأيونوميسين النانومولار الثابت 250 نانومولار ، لا يتغير تأثير PMA بشكل كبير عن طريق رفع تركيز محفز التنشيط من اثنين إلى 250 نانوغرام لكل مليلتر.

كما أنه لا يوجد فرق ملحوظ في انتشار الخلايا التائية التي لوحظت. تثبط الأدوية المثبطة للكالسينيورين جزئيا تكوين الخلايا التائية وانتشارها. علاج الخلايا التائية بالمركبات المثبطة للمناعة التي تستهدف العامل النووي للكالسينيورين للخلايا التائية المنشطة يثبط الاستجابة الأريمية بنسبة 72 بالمائة تقريبا.

Rapamycin و FTY720 تأثيرات معتدلة ولكنها ذات دلالة إحصائية على تكوين الأريمية. بينما يبدو أن TRAM34 لا يؤثر على تكاثر الخلايا التائية في الفئران حتى عند تركيزات 700 نانومولار. عندما يتم استخدام الرابامايسين والسيكلوسبورين أ معا ، يتم تثبيط تكوين الأريمة تماما.

لوحظت نتائج مماثلة مع الخلايا التائية الفئرانية التي تم تنشيطها بخرز مغناطيسي مترافق مضاد ل CD3 و CD28. يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد تأثيرات الأدوية المعدلة للمناعة المختلفة بنجاح ، مما يعطي تقييما أفضل لفاعلية الدواء مقارنة بمقايسات التكاثر النموذجية التي تشمل أيضا مساهمات من الخلايا المبرمج والنخراد. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن قياس ما يصل إلى 15 عينة داخل وخارج مما يسمح بالقياس الكمي المتزامن واللاحق لكل من معدلات تكوين الأريمة والانتشار.

في بعض الأحيان يمكن أن تدخل فقاعات الهواء في خلية التدفق مما يجعل القياس غير قابل للاستخدام ، لذلك يجب فحص جميع الصور بحثا عن فقاعات الهواء قبل قبول البيانات من كل تجربة للتحليل. أحد قيود هذا الإجراء هو أنه إذا كان هناك الكثير من الحطام في العينة ، فقد يعامل القياس الحطام كخلايا قابلة للحياة. مع التعديلات المناسبة ، يمكن تكييف هذا الاختبار لدراسة تغير حجم الخلية في العدلات وخلايا الكبد.