بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية كلوستريديوم ديفيسيل في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

الهدف العام من طريقة التصوير الميكروبيولوجي هذه هو توفير وسيلة وصفية أكثر للتمييز بين التأثيرات المظهرية للعلاج الدوائي. لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة حقا في مجال الأمراض المعدية. النظر على وجه التحديد إلى التأثيرات المورفولوجية لبعض المضادات الحيوية وكيف تقتل المطثية العسيرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين التصوير عالي الدقة وتقنيات زراعة الخلايا في المختبر لتوفير نظرة مفصلة لعمل القتل الصيدلاني. قد يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج عدوى المطثية العسيرة ، أو CDI باختصار. والسبب هو أن هذه التقنية قد توفر وسيلة لتحديد كيف يمكن أن يكون المضاد الحيوي مفيدا في علاج CDI.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعمل الدوائي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل نموذج الثقافة المختلطة أو الدراسات الحيوانية في الجسم الحي. بشكل عام ، يكافح الأفراد مع هذه الطريقة الجديدة لأن زراعة المطثية العسيرة وتشغيل المجهر الإلكتروني الماسح يمثل تحديا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول التمييز بين أنماط عمل المضادات الحيوية المختلفة.

أن أقدم لكم فريق البحث الذي ستلتقيون به اليوم. جهانجير علم أستاذ وعالم أحياء دقيقة. ينسق جميع أنشطة المختبر التي ستراها اليوم.

تسنوفا راشد طالبة دراسات عليا في المختبر. إنها تقوم بالكثير من علم الأحياء الدقيقة اليومي. يوجيني باسيري زميلة ما بعد الدكتوراه.

لقد علمت تسنوفا بالفعل العديد من المهارات وتساعد أيضا في المختبر. براد إندريس هو طبيب آخر بعد الدكتوراه في المختبر. سيقوم بالكثير من الفحص المجهري بمساعدة Long Chang.

لتحضير عزل البيئة أثناء ارتداء قفازات معقمة ، استخدم شاشا قطنيا معقما مسبقا لمسح سطح أي منطقة ذات أهمية ، مثل الأرضية أو الباب أو المقبض أو الرف. ثم ضع المسحة في أنبوب معقم. تغيير القفازات بين العينات.

لتحضير العزلات السريرية ، استخدم حلقة التلقيح لوضع 10 إلى 100 ملليغرام من عينات البراز السريري على أجار السيفوكستين سيكلوسيرين الفركتوز ، أو CCFA ، وقم بتنبيب العينات في ظل ظروف لاهوائية صارمة لمدة 48 إلى 72 ساعة. قم بتخزين المستعمرات المعزولة من مخزون المطثية العسيرة في قوارير مجمدة عند سالب 80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات. قم بإثراء عينات المسحة البيئية بتسريب قلب الدماغ ، أو مرق BHI ، باستخدام 05٪ من توروكولات الصوديوم وضع العينات في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام.

جهاز طرد مركزي واحد مليلتر من الثقافة عند 10 ، 000 مرة G ، واستخدم 100 ميكرولتر من الإيثانول لإعادة تعليق الحبيبات. ضع 50 ميكرولترا من الخلايا المعاد تعليقها على ألواح CCFA واحتضان الثقافات في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة. قم بتخزين المستعمرات المعزولة من مخزون المطثية العسيرة في قوارير مجمدة عند سالب 80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.

استخدم كاشف تراص اللاتكس ، أو PCR ، لاختبار مستعمرات المطثية العسيرة المشتبه بها. قم بزراعة سلالات المطثية العسيرة البيئية أو السريرية المنقاة على ألواح أجار الدم في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. استخدم حلقة التلقيح لأخذ مستعمرة معزولة واحدة ونقلها إلى خمسة ملليلتر من وسط BHI في أنبوب سعة 15 ملليلترا.

ثم قم بزراعة الثقافة في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. استخدام BHIS الطازج المخفض مسبقا المكمل بتوروكولات الصوديوم والتركيز المناسب للمضادات الحيوية لتخفيف المزارع المسبقة من 1 إلى 100 إلى حوالي 10 إلى CFU السادس لكل مليلتر. باستخدام ماصة ، اجمع عينة ملليلتر واحدة في كل نقطة زمنية وقم بلوحة أو انشر كمية صغيرة على صفيحة أجار الدم.

احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية واحسب العدد الناتج من المستعمرات لتحديد CFUs. اجمع ملليلتر واحد من الخلايا من كل نقطة زمنية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 10،000 مرة G لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واستخدم PBS لغسل الخلايا.

قم بتدوير العينات مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية. ثم استخدم ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد لإعادة تخفيف الخلايا واحتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد تدوير العينات مرة أخرى والتخلص من المادة الطافية ، استخدم الماء المقطر لغسل الخلايا مرتين قبل إعادة تخفيف الخلايا في 100 ميكرولتر من الماء المقطر.

اضبط مستوى الصوت حسب تعكر المحلول. بعد وضع العلامات على زلات الغطاء ، أضف 40 ميكرولترا من العينة عليها. تحت غطاء التدفق ، احتضان زلات الغطاء لمدة 15 دقيقة لتبخر السائل والسماح للخلايا بالالتصاق بالزجاج.

إذا كان السائل لا يزال موجودا ، فاستخدم منفاخا لإزالته. ضع زلات الغطاء في آلة الاخرق المكتبية وقم بتثبيتها لأسفل. قم بتأمين الذهب الخالص في آلة الاخرق.

ثم قم بتشغيل الجهاز وابدأ في الاخرق عند ضغط منخفض. قم بتغطية الخلايا لمدة 30 ثانية عند 80 ميكرو أمبير ، وهو ما يترجم إلى 20 نانومتر من طلاء الذهب. لبدء التصوير ، قم أولا بالتنفيس عن محرك البحث بشكل صحيح في برنامج الكمبيوتر بالضغط على زر Vent.

بعد طلاء الخلايا ، انقلها إلى المجهر الإلكتروني الماسح ، أو SEM. باستخدام شريط الكربون ، قم بتأمين زلقات الغطاء المطلي على المسرح المعدني. بمجرد تنفيس التسويق عبر محرك البحث ، يجب أن يفتح الباب بسهولة.

قم بقفل المرحلة المعدنية في غرفة SEM عن طريق تثبيتها. بعد ذلك ، انقر فوق الزر "ضخ" في البرنامج. عندما يقرأ النظام مرة أخرى بشكل جيد ، سيكون SEM جاهزا للاستخدام.

ضمن علامة التبويب كاشف ، انقر فوق كاشف SE. قم بتشغيل الشعاع بالنقر فوق الزر الذي يعرض الجهد. ابدأ التصوير بجهد أقل قبل زيادة الجهد.

ستظهر صورة بعد تشغيل الحزمة. باستخدام وظيفة التتبع ، ابحث عن منطقة على زلات الغطاء المطلي للصورة. قم بتكبير المنطقة وابحث عن هياكل على شكل قضيب ، والتي تمثل المطثية العسيرة.

لمعايرة النظام ، قم بتكبير الصورة وتركيزها بشكل خشن ، وربط Z بمسافة العمل الحرة. يجب أن يتم ذلك على مسافات عمل متعددة ، مثل 15 و 9 و 5 ملليمترات. ثم قم بالتبديل إلى وضع التصوير فائق الدقة.

استخدم مفاتيح تبديل التركيز البؤري الخشنة والدقيقة لبدء التركيز البؤري بتكبير عالي. اضبط تبديل الاستجماتيزم للحصول على صورة أكثر وضوحا ، وتحقق من وضوح الصورة باستخدام برنامج الكمبيوتر لتكبير الصورة رقميا. استخدم المسح البطيء لجمع صورة عالية الجودة.

احفظ الصورة التي تم جمعها كملف tiff لتحليلها لاحقا ، مع التأكد من تحديد شريط البيانات إذا كان سيتم إجراء القياسات أثناء التحليل. اجمع الصور بزوايا مختلفة للكشف عن مزيد من معلومات العمق عن طريق إمالة المسرح على التسويق عبر محرك البحث. تحسين التركيز والاستجماتيزم قبل جمع صورة مسح بطيئة.

بعد اكتمال التصوير ، قم بإيقاف تشغيل الشعاع ورفع مسافة العمل إلى 20 ملم. ثم تنفيس الغرفة وإزالة المسرح. قم بمعالجة الصور ، وافتح ملفات الصور في فيجي.

باستخدام وظيفة الخط ، تتبع شريط المقياس بدقة. انقر فوق علامة التبويب تحليل ؛ ثم اختر الدالة تحديد المقياس. ستظهر نافذة تتطلب إعداد المسافة المعروفة بناء على شريط المقياس.

قم بتغيير وحدة الطول أيضا ، وانقر فوق موافق. أخيرا ، لقياس طول الخلية ، استخدم وظيفة الخط لتتبع الخلية بالكامل. حدد علامة التبويب تحليل مرة أخرى ، ثم انقر فوق قياس.

يجب أن يظهر الطول في الوحدات المشار إليها سابقا. تظهر هذه الصور الخلايا الخضرية المطثية العسيرة التي تم التقاطها خلال المرحلة الأسية من منحنى النمو ، بالإضافة إلى خلايا بوغ. الخلايا الخضرية عبارة عن هياكل طويلة وناعمة على شكل قضيب. في حين أن الجراثيم عبارة عن هياكل بيضاوية صغيرة ذات مظهر خارجي خشن.

كما هو موضح في هذا الشكل ، تنمو خلايا التحكم وتصل إلى هضبة. في حين أن الخلايا المعالجة بالمضادات الحيوية فانكومايسين وميترونيدازول تنخفض في إجمالي CFUs إلى حد الكشف ، مما يشير إلى تأثير مبيد للجراثيم. كما هو موضح ، فإن الفانكومايسين والميترونيدازول فعالان في قتل المطثية العسيرة بتركيزات فائقة من الميكروفون. لإثبات فائدة استخدام SEM لتصوير المطثية العسيرة ، تم تصوير الخلايا قبل وبعد العلاج الدوائي لتحديد كيفية تغير التشكل.

في حالة الفانكومايسين ، تأثرت بعض جدران الخلايا وكانت بعض الخلايا المعالجة بالميترونيدازول أصغر حجما. لاختبار ما إذا كان حجم الخلية قد تأثر ، تم تحليل طول الخلية باستخدام برنامج فيجي. كما هو موضح في هذه الصورة ، يمكن أن يختلف حجم الخلية الخضرية بعض الشيء في حالة التحكم. لكن معظمها يبلغ طوله حوالي 6 ميكرومترات.

ومع ذلك ، كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، تأثر طول الخلية في الخلايا المعالجة بالميترونيدازول ، ولكن ليس في الخلايا المعالجة بالفانكومايسين. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في أقل من يومين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن عينتك ثابتة وجافة تماما قبل الطلاء والتصوير.

باتباع هذا الإجراء ، يمكننا تنفيذ طرق إضافية للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية استجابة البكتيريا للعلاجات بالمضادات الحيوية. وهذا يمكن أن يعطينا مزيدا من التبصر حول فهم آليات عمل المضادات الحيوية ، على سبيل المثال. تتمتع هذه التقنية بإمكانيات هائلة وقد تمهد الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف علم وظائف الأعضاء وعلم الأدوية في المطثية العسيرة. أتمنى أن تكون قد استمتعت بمشاهدة هذا الفيديو اليوم.

آمل أن يكون ما كسبته من هذا هو كيفية نمو وتوصيف خلايا المطثية العسيرة ، وكيفية النظر إلى حركية قتل المضادات الحيوية ضد المطثية العسيرة ، ثم كيفية تقييم التغيرات المورفولوجية المرتبطة بأنماط القتل هذه باستخدام الفحص المجهري عالي المستوى. أثناء عملنا مع المطثية العسيرة ، يجب أن نتخذ احتياطات إضافية ونستخدم كل الحماية