تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

الهدف العام من تقنية قياس التدفق الخلوي الطيفي هذه هو التمييز بين الفلوروكرومات المختلفة باستخدام أطياف انبعاثها الكاملة. علاوة على ذلك، يتيح هذا البروتوكول تطبيق الفلورة الذاتية كمعلمة مستقلة، مما يسمح بإجراء تحليل دقيق للخلايا المعزولة من الأعضاء الصلبة. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات المناعة وتطور بيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل كيفية تحديد المجموعات الخلوية النادرة.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها الفريدة على تحليل عدد كبير من المعايير في آن واحد، والتحكم في التألق الذاتي للأنسجة الصلبة. وبالرغم من استخدام هذه الطريقة لتحضير معلق خلايا مفردة مشتق من الأمعاء والقلب، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أعضاء أخرى، مثل الرئة، والعضلات الهيكلية، والكبد، والدهون، والكلى. للبدء، قم بعزل وغسل الأمعاء الدقيقة لفأر بالغ.

بعد ذلك، ضع النسيج على مناديل ورقية، وباستخدام مقص حاد، قم بإزالة لويحات باير (Peyer's patches) بعناية. افتح الأمعاء عن طريق قطعها طولياً وقسمها إلى قطع بطول سنتيمتر واحد. ثم انقل النسيج إلى دورق يحتوي على 30 milliliters من محلول HBSS المدعم بنسبة 10% من FCS، وقم بتحضينه عند درجة حرارة 37 °C مع التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة.

بمجرد اكتمال عملية الحضن، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملي لتر وقم برجّه بقوة باستخدام جهاز الـ vortex لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، حضّن المعلق على الثلج لمدة عشر دقائق للسماح للقطع الكبيرة غير المتفككة بالترسيب. بعد ذلك، انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد وقم بتدوير الخلايا بسرعة 120 ×g لمدة سبع دقائق.

بعد تجميع الخلايا في كريات، نقوم بتعليقها في 10 mL من FCS بنسبة 1% في HBSS ثم نقوم بعدّها باستخدام غرفة Neubauer. وقبل صبغ الخلايا، يتم نقل 1 × 10⁶ من الخلايا المعوية إلى أنبوب سعة 5 mL لتحضير عينة ضابطة سالبة. ولتحضير العينة، يُضاف 1 × 10⁶ من الخلايا المعوية، يليه 2 mL من HBSS مع FCS بنسبة 1% إلى أنبوب جديد سعة 5 mL، ثم يتم طرد المعلق مركزياً بسرعة 120 ×g، عند درجة حرارة 4 °C، لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من السائل الطافي، نقوم بتعليق الخلايا في 50 µL من محلول الأجسام المضادة. غلف الأنبوب بورق ألومنيوم وحضن الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. وبمجرد اكتمال التحضين، أضف 2 mL من FCS بتركيز 1% في HBSS إلى العينة وقم بطردها مركزياً عند 120 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق.

تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µL من محلول propidium iodide بتركيز 0.5 µg/mL. بعد قطع رأس جنين الفأر، انقعه في طبق بتري، مبطن بمنشفة ورقية مبللة مسبقاً، ومملوء بـ 50 mL من FCS بتركيز 1% في HBSS. وباستخدام المجهر المجسم، قم بعمل شق في الجانب الأيمن من صدر الجنين وافتح القفص الصدري بعناية، مع تجنب إتلاف القلب.

أمسك الأوعية الدموية الكبيرة واسحب القلب المتصل بالرئتين والغدة الزعترية. انقل الأعضاء إلى طبق بتري سعة 35 مليلتر مملوء بـ 2 مليلتر من FCS بتركيز 1% في HBSS. بعد ذلك، افصل القلب عن الأعضاء المحيطة والأنسجة الضامة.

بعد غسل القلب، انقعه في 1 mL من المحلول الإنزيمي المسخن مسبقاً، وباستخدام ملقط دقيق ومشرط، قم بتقطيع العضو إلى قطع بحجم 1 mm³ تحت المجهر المجسم (stereomicroscope). أضف 1 mL إضافي من المحلول الإنزيمي المسخن مسبقاً وانقل الأنسجة المقطعة إلى أنبوب سعة 5 mL مغلق الغطاء. قم بتحضين العينة في وضع أفقي عند 37 °C لمدة 15 دقيقة.

بمجرد اكتمال فترة التحضين، قم بتجانس النسيج عن طريق السحب والتفريغ المتكرر للمعلق باستخدام ماصة P1000. بعد ذلك، ضع العينات في وضع رأسي واتركها جانباً حتى تترسب شظايا الأنسجة غير المهضومة. ثم انقل السائل الطافي إلى أنبوب سعة 50 milliliters.

أضف 2 mL من FCS بنسبة 10% في HBSS واحفظ الخلايا المعزولة على الثلج. بعد ذلك، أضف 2 mL من المحلول الإنزيمي المسخن مسبقاً إلى أنبوب سعة 5 mL الذي يحتوي على رواسب الأنسجة غير المهضومة، واستمر في هضم الأنسجة كما هو موضح سابقاً حتى لا يتبقى أي نسيج مرئي. قم بطرد معلق الخلايا الناتج مركزياً عند 120 ×g لمدة عشر دقائق.

بعد ذلك، تخلص من الطافي وأعد تعليق الخلايا في 1 milliliters من FCS بتركيز 1% في HBSS، الخالي من كاتيونات الكالسيوم والمغنيسيوم. ولصبغ الخلايا القلبية، انقل 200 microliters من معلق الخلايا إلى آبار طبق 96 بئر ذو قاع مستدير. قم بطرد الطبق مركزياً عند 480 ×g لمدة دقيقة واحدة ثم تخلص من الطافي.

بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا القلبية في 100 µL من محلول الأجسام المضادة. لف الطبق بورق ألومنيوم واتركه في الحاضنة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. وبمجرد اكتمال فترة التحضين، اغسل الخلايا القلبية باستخدام 200 µL من FCS بتركيز 1% في HBSS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم، ثم قم بطرد المعلق مركزياً عند 480 ×g لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 200 µL من FCS بتركيز 1% في HBSS خالٍ من أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم، وانقل المعلق إلى أنبوب سعة 5 mL مملوء مسبقاً بـ 200 µL من FCS بتركيز 1% في HBSS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم. وأخيراً، أضف 400 µL من FCS بتركيز 1% في HBSS خالٍ من كاتيونات الكالسيوم والمغنيسيوم، ويحتوي على 0.5 µg/mL من propidium iodide، ثم قم بترشيح معلق الخلايا عبر مصفاة نايلون بمسام 70 µm. ولتصوير الخلايا، حمّل العينة المصبوغة في جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) وانقر على preview، ثم سجل ما يصل إلى 2 × 10⁶ حدثاً في العينة بالنقر على acquire.

في علامة تبويب التحليل، افتح نافذة لوحة الألوان وقم بتسجيل جميع المعلمات المدروسة عن طريق إضافة الفلوروكروم مع المؤشر المقابل له. تأكد من تضمين معلمات الفلورة الذاتية والحيوية. في نافذة التحكم، وضمن قائمة الأنابيب، قم بتحليل أول عينة مصبغة واحدة تحتوي على حبيبات التعويض.

بعد ذلك، في ورقة العمل، انقر على أداة تصميم المضلع وقم بتحديد مجموعة الخرزات في مخطط FSC SSC. انقر نقرًا مزدوجًا على البوابة لإنشاء مخطط فرعي للخرزات المحددة. ثم قم بتحديد الخرزات الموجبة والسالبة بشكل منفصل.

تحقق من مجموعة الخلايا الوليدة المختارة من خلال البوابات المتتالية واستبعاد القيم المتطرفة في كل جزء إيجابي وسلبي. بعد ذلك، قم بتحميل البوابات السلبية والإيجابية في نافذة فك المزج (un-mixing). ثم حدد عينة الخلايا غير المصبوغة من قائمة الأنابيب وصمم بوابات منفصلة للخلايا ذات الفلورة الذاتية والخلايا غير ذات الفلورة الذاتية.

بمجرد تحديد البوابات السالبة والموجبة لجميع المعلمات، بما في ذلك التألق الذاتي والحيوية، انقر فوق حساب. ثم، قم بتطبيق عملية فك الخلط (un-mixing) على العينات التي تم تحليلها. ولتحليل البيانات، قم بتحديد بوابات الخلايا في مخطط للـ SSC مقابل FSC واستبعد الخلايا الميتة المصبوغة بـ propidium iodide.

أخيراً، قم بتحديد البوابات لجميع المجموعات الخلوية المستهدفة. تُعرض هنا نتائج تحليلات قياس التدفق الخلوي وقياس التدفق الطيفي للخلايا المعزولة من قلب الجنين والمصبوغة بالأجسام المضادة anti-TER119 وanti-CD45 وanti-Sca-1. وقد تم الكشف عن مجموعة فرعية من الخلايا ذات الفلورة الذاتية بواسطة جهازَي قياس تدفق تقليديين، بينما في قياس التدفق الطيفي لم تُصنف هذه الخلايا على أنها ذات فلورة ذاتية، بل كانت مدرجة ضمن المجموعة السلبية لـ CD45 TER119.

تم بعد ذلك تحليل الخلايا التي تم تحديدها بواسطة قياس التدفق الخلوي التقليدي على أنها ذات فلورة ذاتية، وليست خلايا موجبة لـ CD31، للكشف عن تعبير النسخ النوعية للخلايا العضلية القلبية. وقد وُجدت مستويات عالية من تروبونين القلب ونسخ شبيهة بتلك الموجودة في الخلايا العضلية الأذينية في مجموعة الخلايا ذات الفلورة الذاتية، مما يؤكد أن مجموعة فرعية كبيرة من الخلايا العضلية القلبية يتم إغفالها في قياس التدفق الخلوي التقليدي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثماني ساعات تقريبًا، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر وجوب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد وفي إطار زمني محدد لضمان بقاء الخلايا حيوية. وباتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليلات للبروتينات داخل الخلايا وعلامات سطحية إضافية من أجل الإجابة على تساؤلات تتعلق بمسارات جزيئية محددة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة وبيولوجيا الخلايا الجذعية أو التطور لاستكشاف وعزل مجموعات نادرة من أعضاء مختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا من الأنسجة الخلوية وصبغها، وكيفية تحليل تعبير الواسمات السطحية عن طريق قياس التدفق الخلوي الطيفي الذي يتغلب على القيود الناتجة عن التألق الذاتي للخلايا. لا تنسَ أن العمل باستخدام propidium iodide يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.