الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

الهدف العام من هذه الطريقة هو زرع سقالات حاملة للخلايا البشرية في الفئران لإنشاء منافذ نخاع عظم متوافقة مع البشر ثم الصورة الحية لسلوك الخلايا البشرية داخل الغرسات. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الدم البشري لأنها تسمح بإعادة إنتاج وصورة حية بدقة الخلية المفردة مكونات مختلفة من نخاع العظام. يعد تعدد استخدامات هذا النظام أحد مزاياه الرئيسية ، لأنه يسمح بزرع مكونات متخصصة مختلفة واحدة تلو الأخرى أو مجتمعة.

يمكن تطبيق هذه المنهجية على مجالات بحثية أخرى ، مثل ورم خبيث أو دراسات فحص الأدوية. باستخدام تقنية التعقيم المناسبة ، ابدأ بتقطيع إسفنجة جيلاتين معقمة إلى 24 قطعة من نفس الحجم. أعد تشكيل سقالات الجيلاتين عن طريق الغمر في الإيثانول ثم في PBS.

ثم ربت كل سقالة برفق على منديل معقم لإزالة السائل الزائد ، وانقل السقالات إلى آبار فردية من لوحة 24 بئرا منخفضة للغاية. باستخدام حقنة الأنسولين ، قم بحقن بعناية مرة واحدة من 10 إلى الخامس إلى واحد في 10 إلى الخلايا اللحمية السادسة في 50 ميكرولترا من وسط الثقافة في كل سقالة ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. عند حقن الخلايا في السقالة ، تأكد من عدم وجود تسرب من السقالة.

بعد ساعة واحدة ، املأ كل بئر بثلاثة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الطازجة ، وأعد السقالات إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة ، قم بحقن مرة واحدة 10 إلى الخلايا المكونة للدم الخامسة في السقالات ، متبوعا بالحضانة وإضافة المزيد من الوسائط ، وحضانة 24 ساعة كما هو موضح للتو. لتوليد البروتين المورفولوجي البشري المؤتلف ، سقالتان حاملتان ، ضع السقالات المعاد تشكيلها في آبار فردية من صفيحة 96 بئر على شكل حرف U ، وأضف خمسة ميكرولترات من البروتين المورفولوجي للعظام البشرية المؤتلف اثنين إلى كل سقالة.

ثم قم بتغطية السقالات ب 20 ميكرولتر من الثرومبين و 20 ميكرولتر من الفيبرينوجين. للزرع الجراحي للسقالات المهندسة بيولوجيا ، قم أولا بحلق المنطقة الجراحية على ظهر الفأر التجريبي ، واستخدم طرف قطني مغموس في الكلورهيكسيدين المخفف لتنظيف سطح الجلد المكشوف ثلاث مرات في كل اتجاه. بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما ومشرطا لعمل شق من 0.5 إلى 0.7 سم من الأمام إلى الخلفي في الجلد ، وأدخل الملقط تحت الأنسجة تحت الجلد لعمل جيب.

أدخل السقالة بعمق في الجيب ، وأغلق الشق بالغراء الجراحي. اسمح للسقالات المزروعة بالتطور لمدة ثمانية إلى 24 أسبوعا قبل الإخراج. بعد إعطاء المواد الفلورية عن طريق الوريد والقتل الرحيم للحيوانات ، قم بتعقيم الجلد كما هو موضح للتو وقم بعمل شق طولي في الجلد على ظهر ، بالقرب من موقع الزرع الأصلي.

افصل الجلد بعناية عن الجيب تحت الجلد حيث تم زرع السقالة ، ثم استخدم الملقط لإمساك السقالة برفق وقطع الغشاء المتبقي والأنسجة المحيطة بالسقالة بعناية لاستعادة الهيكل. استخدم غراء لاصق سريع المفعول لتأمين السقالة على طبق بتري 35 × 10 مل. بالنسبة للبروتين المورفوجيني للعظام ، استخدم سقالتين ، قبل ملء اللوحة ب PBS ، استخدم مثقاب جراحي تحت مجهر جراحي لتخفيف سطح العظام ، مما يسمح بتصور الفلوروفورات والتقاط الصور بدقة عالية.

كن حذرا بشكل خاص أثناء عملية الحفر لأن سمك العظم يختلف عادة بين السقالات ، ومن المهم عدم كسر السطح. املأ الطبق بدرجة حرارة الغرفة PBS. للتصوير المجهري ثنائي الفوتون للسقالات المهندسة بيولوجيا ، ضع السقالة على مرحلة المجهر متحد البؤر ، وحدد عدسة الغمر في الماء 20 مرة 1.0 NA.

بعد ذلك، في وضع الاستحواذ على برنامج التصوير، حدد مربع إظهار الأدوات اليدوية. في قائمة الليزر ، قم بتشغيل ليزر 2 فوتون ، واسمح لليزر بالتسخين والاستقرار. عندما يكون الليزر جاهزا، في قائمة إعداد التصوير، قم بتنشيط وضع القناة وتبديل مسار كل إطار.

في قائمة مسار الضوء، حدد مقسم الشعاع الرئيسي غير الممسوح ضوئيا MBS 760 plus. قم بتنشيط أجهزة الكشف الأربعة غير الممسوحة ضوئيا وقم بتعيين التكوين كما هو موضح في المخطط. في قائمة القنوات ، اضبط الطول الموجي لليزر على 890 نانومتر والطاقة على 50٪ اضبط سيد الكسب على 500 إلى 600 ، والإزاحة الرقمية على الصفر ، والكسب الرقمي على 15 لكل قناة.

في وضع الاستحواذ ، قم بتعيين المعلمات المناسبة للحصول على صور عالية الدقة دون الإضرار بالأنسجة وتبييض الفلوروفورات. ثم اضبط التكبير/التصغير على واحد للمسح الأولي للصورة. عند تعيين جميع المعلمات، اخفض العدسة حتى تلامس المحلول الملحي، واضبط تركيز العدسة يدويا باستخدام مصباح كمصدر للضوء.

الآن قم بتنشيط قائمة Z-stack ، وحدد الوظيفة الأخيرة الأولى. اضبط الفاصل الزمني المطلوب بين شريحتين متتابعتين وحدد مباشرا لتصوير مسح ضوئي مباشر للعينة ، وضبط الكسب الرقمي والإزاحة الرقمية حسب الضرورة للحصول على درجة إضاءة مثالية. لتصور قنوات متعددة في نفس الوقت، حدد وظيفة التقسيم.

في قائمة المسرح ، أثناء وجودك في الوضع المباشر ، امسح الصورة ضوئيا وحدد مناطق الاهتمام ، مثل موقع تجاويف العظام. عند اكتمال فحص العينة ، انتقل إلى منطقة الاهتمام الأولى ، واستخدم المجموعة أولا وقم بتعيين الوظائف الأخيرة في الوضع المباشر لتعيين الجزء العلوي والسفلي من مكدس Z ثلاثي الأبعاد المحيط بمنطقة الاهتمام. ثم اضبط المركز ، C ، وانقر فوق الزر بدء التجربة لبدء الحصول على صورة Z-stack لمنطقة الاهتمام.

عند اكتمال الاستحواذ، احفظ الصور في المجلد المخصص، وامسح منطقة الاهتمام التالية. في هذه الصور التمثيلية ، يمكن ملاحظة التشكل الإجمالي للسقالات المختلفة التي تم استردادها من الفئران NSG التي تعاني من نقص المناعة بعد ثمانية أسابيع من الزرع. يزيد البذر المشترك مع الخلايا البطانية البشرية من الأوعية الدموية للسقالة ، في حين أن إضافة البروتين المورفولوجي للعظام البشرية المؤتلف الثاني يحفز تكوين العظام.

تكشف هذه السقالات التي تم تصويرها بواسطة الفحص المجهري الحي ثنائي الفوتون عن وجود الأوعية الدموية في السقالات والنقش طويل الأمد للخلايا المكونة للدم البشرية في حمة السقالة. توضح السقالات المزروعة بالخلايا البطانية واللحمية المتوسطة البشرية مشاركة الخلايا البطانية البشرية في تكوين الأوعية داخل السقالة ، مما ينتج عنه وعوية كيميائية بشرية. يمكن تصور تكوين أنسجة العظام عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون ، بالإضافة إلى تكوين تجاويف في الأوعية الدموية المتوافقة مع البشر في الأنسجة الداخلية ، والتي تشبه إلى حد كبير الأنسجة الداخلية لنخاع العظم.

علاوة على ذلك ، في البروتين المورفوجيني للعظام البشرية المؤتلف ، سقالتان حاملتان ، يشبه مورفولوجيا الأنسجة داخل السقالة نخاع العظم الناضج مع الأنسجة الدهنية ، مما يشير إلى أن الخلايا اللحمية الوسيطة البشرية تساهم أيضا في تكوين الأنسجة الدهنية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لجميع المهندسين الحيويين وسقالات الفئران الرئيسية. تذكر دائما الحفاظ على بيئة زهد ، وتوخي الحذر الشديد أثناء التعامل مع السقالات.

ضع في اعتبارك القيود المرتبطة بهذه الطريقة ، مثل الوهم البشري والفأر في الأنسجة. تذكر أنه بعد التصوير ، يمكن استخدام العينات لمزيد من الدراسات ، حيث يمكن هضم السقالات ، وبالتالي يمكن استرداد الخلايا الحية منها.