الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

الهدف العام من هذه الطريقة هو زرع سقالات حاملة لخلايا بشرية في الفئران لإنشاء منافذ نخاع عظمي مأنسنة، ومن ثم التصوير الحي لسلوك الخلايا البشرية داخل الغرسات. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تكوين الدم البشري لأنها تسمح بإعادة إنتاج وتصوير حي بدقة الخلية الواحدة لمكونات مختلفة من نخاع العظم. وتعد تعددية استخدام هذا النظام إحدى مزاياه الرئيسية، حيث تتيح زرع مكونات مختلفة من المنافذ واحدًا تلو الآخر أو بمجموعات.

يمكن تطبيق هذه المنهجية في مجالات بحثية أخرى، مثل دراسات نقائل الأورام أو فحص العقاقير. باستخدام التقنية المعقمة المناسبة، ابدأ بتقطيع إسفنجة جيلاتينية معقمة إلى 24 قطعة متساوية الحجم. أعد تكوين السقالات الجيلاتينية عن طريق الغمر في الإيثانول ثم في PBS.

بعد ذلك، جفف كل سِقالة برفق باستخدام منديل معقم لإزالة السائل الزائد، ثم انقل السقالات إلى آبار منفصلة في طبق 24 بئراً فائق انخفاض الالتصاق. وباستخدام حقنة إنسولين، احقن بعناية من 1×10⁵ إلى 1×10⁶ من الخلايا السدوية في 50 µL من وسط الزرع داخل كل سقالة، ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا. عند حقن الخلايا في السقالة، تأكد من عدم وجود أي تسرب من السقالة.

بعد مرور ساعة واحدة، املأ كل بئر بثلاثة مليلترات من وسط زراعة الخلايا الطازج، وأعد السقالات إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة، احقن 1×10⁵ من الخلايا المكونة للدم في السقالات، يتبع ذلك التحضين وإضافة المزيد من الأوساط، ثم التحضين لمدة 24 ساعة كما تم توضيحه للتو. ولتوليد سقالات حاملة لبروتين تشكل العظم البشري المؤتلف الثاني (rhBMP-2)، ضع السقالات المعاد تشكيلها في آبار فردية في طبق 96 بئر بقاع على شكل حرف U، وأضف خمسة ميكرولترات من بروتين تشكل العظم البشري المؤتلف الثاني إلى كل سقالة.

بعد ذلك، غطِّ السقالات بـ 20 microliters من الثرومبين و20 microliters من الفبرينوجين. ولغرض الزرع الجراحي للسقالات المهندسة حيويًا، ابدأ بحلاقة المنطقة الجراحية على ظهر الفأر التجريبي، واستخدم مسحة قطنية مغموسة في الكلورهيكسيدين المخفف لتنظيف سطح الجلد المكشوف ثلاث مرات في كل اتجاه. بعد ذلك، استخدم ملقطًا معقمًا ومشرطًا لإجراء شق في الجلد بطول 0.5 إلى 0.7 centimeter من الجهة الأمامية إلى الخلفية، ثم أدخل الملقط تحت النسيج تحت الجلدي لإنشاء جيب.

أدخل السقالة بعمق داخل الجيب، ثم أغلق الشق باستخدام الغراء الجراحي. اترك السقالات المزروعة لتنمو لمدة تتراوح من 8 إلى 24 أسبوعاً قبل استخراجها. بعد الإعطاء الوريدي للمواد الفلورية وقتل الحيوانات رحمةً، قم بتعقيم الجلد كما تم توضيحه للتو، ثم أجْرِ شقاً جلدياً طولياً في ظهر الحيوان، بالقرب من موقع الزرع الأصلي.

افصل الجلد بعناية عن الجيب تحت الجلدي حيث تم زرع السقالة، ثم استخدم الملاقط للإمساك بالسقالة برفق وقم بقص الغشاء المتبقي والأنسجة المحيطة بالسقالة بعناية لاستعادة الهيكل. استخدم غراءً لاصقاً سريع المفعول لتثبيت السقالة في طبق بتري بحجم 35 في 10 milliliter. بالنسبة لسقالات البروتين المكون للعظم 2، وقبل ملء الطبق بـ PBS، استخدم مثقاباً جراحياً دقيقاً تحت مجهر جراحي دقيق لترقيق سطح العظم، مما يسمح برؤية الفلوروفورات والالتقاط عالي الدقة للصور.

كن حذراً بشكل خاص أثناء عملية الثقب لأن سماكة العظم تختلف عادةً بين السقالات، ومن المهم عدم كسر السطح. املأ الطبق بـ PBS بدرجة حرارة الغرفة. ولتصوير السقالات المهندسة بيولوجياً باستخدام مجهر الفوتونين، ضع السقالة على منصة المجهر البؤري، واختر عدسة الغمر المائي ذات التكبير 20 مرة وفتحة عددية 1.0 NA.

بعد ذلك، وفي وضع الاستحواذ في برنامج التصوير، حدد مربع إظهار الأدوات اليدوية. وفي قائمة الليزر، قم بتشغيل ليزر الفوتونين، واترك الليزر ليرتفع درجة حرارته ويستقر. وعندما يصبح الليزر جاهزاً، قم بتفعيل وضع القناة في قائمة إعداد التصوير، وقم بتفعيل خيار تبديل المسار في كل إطار.

من قائمة مسار الضوء (light path)، اختر "غير ممسوح" (non descanned) ومقسم الحزمة الرئيسي MBS 760 plus. قم بتنشيط الكواشف الأربعة غير الممسوحة واضبط التكوين كما هو موضح في المخطط. في قائمة القنوات، اضبط الطول الموجي لليزر على 890 nanometers والقدرة على 50%. اضبط المعزز الرئيسي (gain master) على قيمة تتراوح بين 500 إلى 600، والإزاحة الرقمية (digital offset) على صفر، والمعزز الرقمي (digital gain) على 15 لكل قناة.

في وضع الالتقاط، حدد المعلمات المناسبة للحصول على صور عالية الدقة دون إتلاف النسيج أو تبييض الفلوروفورات. ثم اضبط التكبير على 1 للمسح الأولي للصورة. وعندما يتم ضبط جميع المعلمات، اخفض العدسة حتى تلامس المحلول الملحي، واضبط تركيز العدسة يدويًا باستخدام مصباح كمصدر للضوء.

الآن قم بتنشيط قائمة Z-stack، واختر وظيفة first last. حدد الفاصل الزمني المطلوب بين شريحتين متتاليتين، واختر live لإجراء مسح حي للعينة، مع ضبط الكسب الرقمي (digital gain) والإزاحة الرقمية (digital offset) حسب الضرورة للحصول على تعريض ضوئي مثالي. ولتصوير قنوات متعددة في آن واحد، اختر وظيفة split.

في قائمة المنصة، وأثناء وضع البث المباشر، قم بمسح الصورة وتحديد مناطق الاهتمام، مثل مواقع تجاويف العظام. عند اكتمال مسح العينة، انتقل إلى منطقة الاهتمام الأولى، واستخدم وظيفتي "تعيين الأول" (set first) و"تعيين الأخير" (set last) في وضع البث المباشر لتحديد الحد العلوي والسفلي لمجموعة الصور ثلاثية الأبعاد Z-stack المحيطة بمنطقة الاهتمام. بعد ذلك، قم بتعيين المركز، C، وانقر على زر "بدء التجربة" لبدء عملية الحصول على صور Z-stack لمنطقة الاهتمام.

عند اكتمال عملية الاستحواذ، احفظ الصور في المجلد المخصص، ثم قم بمسح المنطقة ذات الأهمية التالية. يمكن في هذه الصور التمثيلية ملاحظة المورفولوجيا الإجمالية لسقالات مختلفة تم استخراجها من فئران NSG ناقصة المناعة بعد ثمانية أسابيع من الزرع. يؤدي الاستزراع المشترك مع الخلايا البطانية البشرية إلى زيادة التوعي في السقالة، بينما يؤدي إضافة البروتين المكون للعظم البشري المؤتلف الثاني إلى تحفيز تكوين العظام.

تكشف هذه السقالات التي تم تصويرها باستخدام مجهر الفوتونين الحي عن وجود أوعية دمويّة داخل السقالات والاندماج طويل الأمد للخلايا المكونة للدم البشرية في متن السقالة. وتوضح السقالات المستزرعة بالخلايا البطانية والخلايا السدوية الميزنكيمية البشرية مشاركة الخلايا البطانية البشرية في تكوين الأوعية داخل السقالة، مما يؤدي إلى ظهور أوعية دموية خيمرية (هجينة) بين الفئران والبشر. ويمكن تصور تكوين النسيج العظمي بواسطة مجهر الفوتونين، بالإضافة إلى تكوين تجاويف في الأوعية الدموية المأنسنة في النسيج الداخلي للعظم، وهو ما يشبه إلى حد كبير النسيج الداخلي لنخاع العظم.

علاوة على ذلك، في السقالات الحاملة لبروتين تشكيل العظام البشري المأشوب الثاني، تشبه مورفولوجيا النسيج داخل السقالة نخاع العظام الناضج مع وجود نسيج دهني، مما يشير إلى أن الخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية تساهم أيضاً في تكوين النسيج الدهني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لجميع الجوانب الهندسية الحيوية والسقالات الفأرية الرئيسية. تذكر دائماً الحفاظ على بيئة معقمة، وتوخَّ الحذر الشديد عند التعامل مع السقالات.

ضع في اعتبارك القيود المرتبطة بهذه الطريقة، مثل تكون خيمرات بشرية-فأرية في الأنسجة. تذكر أنه يمكن استخدام العينات لإجراء دراسات إضافية بعد التصوير، حيث يمكن هضم السقالات، وبالتالي استعادة الخلايا الحية منها.