G2-seq: عالية إنتاجية على أساس تسلسل تقنية لتحديد تكرار متأخر مناطق الجينوم

الهدف العام من هذا الإجراء للتسلسل العميق للحمض النووي من الخلايا التي تم فرزها وفقا لمرحلة دورة الخلية هو تحديد مناطق الجينوم التي تتكاثر في وقت متأخر للغاية من دورة الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكرار الحمض النووي مثل مناطق الجينوم التي تواجه مشكلة في إكمال تكرار الحمض النووي وبالتالي فهي معرضة بشكل خاص لإعادة ترتيب الجينوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه على الرغم من أنها بسيطة للغاية من وجهة نظر تجريبية ، إلا أنها توفر رؤية غنية بشكل مدهش لديناميكيات النسخ المتماثل الجيني.

للبدء ، قم بتلقيح 15 مليلتر من أنابيب الاختبار التي تحتوي على ثمانية ملليلتر من YEPD بخلايا الخميرة ذات الأهمية. الوسط الاصطناعي أو الغني مقبول. استزراع الخلايا طوال الليل لمدة 12 ساعة على الأقل لجمعها أثناء توزيع مرحلة السجل الحقيقي.

في اليوم التالي عندما تكون الثقافات بكثافة تتراوح من خمسة إلى 15 مليون خلية لكل مليلتر ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في 1.5 مل من 70٪ من الإيثانول. ثم انقل المعلق إلى أنبوب ميكروفيج سعة 1.6 مل واترك الخلايا تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو لمدة ثلاث ساعات على الأقل على الجليد. بعد التلقيح ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في مليلتر واحد من سترات الصوديوم.

أخيرا ، صوتنة الخلايا لفترة وجيزة مرتين. ثم كرر دورة الطرد المركزي وأعد تعليق الخميرة في مليلتر واحد من سترات الصوديوم التي تحتوي على RNase. اسمح ل RNase بالتفاعل مع الخميرة عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية أو حمام مائي.

بعد معالجة RNase ، أضف 50 ميكرولترا من محلول البروتيناز K إلى الخليط واستمر في التفاعل لمدة ساعة عند 50 درجة مئوية. ثم قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في مليلتر واحد من سترات الصوديوم. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا وشفط المادة الطافية باستخدام فراغ.

ثم في الضوء الخافت ، قم بتعليق الخلايا في ملليلتر واحد من سترات الصوديوم مع بقعة الحمض النووي الأخضر. الآن احتضن الخميرة في الظلام لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. للمتابعة ، عد الخلايا باستخدام فارز الخلايا باستخدام بيانات انبعاث 530 نانومتر.

قم بفرزها وفقا لمحتوى الحمض النووي الخاص بها في مراحل دورة الخلية ، G1 S ، وأوائل G2 ، وأواخر G2. اجمع ما لا يقل عن 1.6 مليون خلية أحادية الصيغة الصبغية من كل مرحلة. على الفور بعد فرز الخلايا ، قم بتدويرها لمدة 20 دقيقة. استنشق المادة الطافية وتجميد الحبيبات عند سالب 20 درجة مئوية للتخزين.

لقد وجدنا أن الخطوة الوحيدة الأكثر أهمية لهذا الإجراء هي ببساطة تدوير الخلايا لأسفل على الفور بعد جمعها ، بعد ساعة واحدة من الفرز. يعتمد هذا الاستخراج على مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي للخميرة. ابدأ بإضافة 120 ميكرولتر من محلول الهضم وخمسة ميكرولترات من إنزيم الخميرة المحلل.

ثم امزج الخلايا في خليط التفاعل باستخدام دوامة واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 40 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 120 ميكرولترا من عازلة التحلل وقم بدوامة الخليط بسرعة عالية لمدة 10 إلى 20 ثانية. ثم أضف 250 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطي محتويات الأنبوب جيدا لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب بأقصى سرعة لمدة دقيقتين. ثم انقل المادة الطافية إلى عمود ربط الحمض النووي. قم بتدوير المادة الطافية عبر العمود باستخدام دورة طرد مركزي ذات سرعة قصوى مدتها دقيقة واحدة.

لغسل الحمض النووي على غشاء العمود ، انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد وقم بتطبيق 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الحمض النووي. ثم كرر الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة. كرر خطوة الغسيل هذه مرة أخرى.

لجمع الحمض النووي ، انقل عمود الدوران إلى أنبوب جديد. أضف 60 ميكرولترا من الماء وانتظر من دقيقة إلى ثلاث دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للعمود بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان لعزل الماء الذي يحتوي على الحمض النووي الملوث.

أضف الآن ما بين خمسة و 195 ميكرولترا من المخزن المؤقت عالي الحساسية للحمض النووي مزدوج الشريطة الذي يحتوي على كاشف بتركيز واحد إلى 200. ثم قم بقياس مضان العينة لحساب العائد. توقع جمع ما بين 10 و 50 نانوغرام من الحمض النووي.

الآن استخدام صوتنة لتقسيم الحمض النووي إلى أجزاء تتراوح بين 250 و 350 زوجا أساسيا. ثم استخدم مجموعة قياسية لإعداد مكتبة الحمض النووي وتسلسلها باستخدام ما لا يقل عن 10 ملايين 50 زوجا أساسيا من القراءات أحادية النهاية. تم استخدام الإجراء الموصوف لتحديد مواقع التكاثر المتأخرة في الخميرة الناشئة.

تمت مقارنة الخلايا الطبيعية بتلك التي تفتقر إلى Sir2 ، وهو بروتين ديستيلاز. احتوت البيانات الأولية على طفرات كبيرة يرجع ذلك في الغالب إلى وجود عناصر TY. تمت إزالة هذه المسامير عن طريق وضع حد أقصى لأعماق القراءة إلى 2.5 ضعف متوسط العمق الأحمر لكل عينة.

ثم تم تنعيم البيانات التي تم إزالتها من خلال نافذة منزلقة 20 كيلو بايت. أخيرا ، تم تطبيع البيانات ورسمها كنسب إلى المستويات في G1. ستظهر خلية غير منسوخة تماما عند 0.5 وستظهر خلية مكررة بالكامل في واحدة. في هذه البيانات من الكروموسوم السابع ، كان هناك دليل على وجود منطقة تكاثر متأخرة معروفة في طفرة Sir2.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تلك المناطق من الجينوم التي هي الأخيرة لإكمال تكرار الحمض النووي والتي وبالتالي فهي معرضة بشكل خاص لانكسور الحمض النووي والمشاكل الأخرى المرتبطة بالنسخ المتماثل المتأخر.