أسلوب أنبوب الاسطوانة المعدلة لتصوير متقطعة الذات المترجمة ومتكررة خلال ثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ في نظام مغلق

الهدف العام من طريقة أنبوب الأسطوانة المعدلة لثقافة شرائح الدماغ هو توفير نظام ثقافة مغلق لبقاء الشريحة على المدى الطويل. مع القدرة على تصوير الإزهار المتكرر عالي الدقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تطور الخلايا العصبية والاضطرابات التنكسية العصبية التي تتطلب ملاحظات لنفس الخلايا العصبية بمرور الوقت ، مثل توطين البروتينات الرئيسية المشاركة في تكوين المشبك أو فقدانه.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في نظام الثقافة المغلق بالكامل الذي يسمح بالاستخدام الآمن للفيروسات للتعبير عن البروتين واستخدام أغطية محفورة بالصور لتوطين نفس الخلايا للتصوير. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نزرع شرائح على أغطية داخل أنابيب الأسطوانة ، لكننا احتجنا إلى طريقة أفضل لتصور التغييرات التي تحدث في الشرائح الحية بمرور الوقت. دفعنا الاستخدام الواسع النطاق للنواقل الفيروسية للتعبير عن الجينات المعدلة ومجموعات خلايا معينة للتصوير المجهري إلى تطوير نظام مغلق لحماية المستخدمين والقضاء على تلوث أهداف المجهر.

تسمح القدرة على متابعة مجموعة متطابقة من الخلايا داخل شرائح الدماغ بمرور الوقت بإجراء دراسات حول تطور التغيرات المرضية وتغيير المشبك في نماذج القوارض للاضطرابات العصبية البشرية. للبدء ، قم بإعداد رف أنبوب الأسطوانة وقم بعمل رقصة للمساعدة في حفر ثقب في أنابيب الأسطوانة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. باستخدام الرقصة ، أمسك في موضعه أنبوب ثقافة بلاستيكي مسطح الجوانب ، سنتيمتر واحد ، بحيث يكون الجانب المسطح متجها لأعلى.

ثم قم بحفر ثقب قطره ستة ملليمترات مع المركز على بعد سنتيمتر واحد من الأسفل ومتمركز بين جانبي الأنبوب. باستخدام أداة إزالة الحواف الدوارة ، قم بتنعيم حواف الحفرة وعمل أربعة أخاديد على الحافة الداخلية للفتحة لتسهيل تصريف الحفرة أثناء الدوران. بعد ذلك ، اشطف الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم جففها بالهواء في خزانة أمان بيولوجية.

بتعقيم الأنابيب في حوالي أقراص مطاط السيليكون اللاصقة المثقوبة مقاس 12 ملم لمدة 40 دقيقة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية. بعد 20 دقيقة ، قم بإعادة وضع الأنابيب والأقراص بحيث يتم تعقيم جميع الأسطح المكشوفة. بعد ذلك ، قم بإزالة الدعامة البيضاء من القرص اللاصق ، وقم بمحاذاة الثقوب وقم بتثبيت مطاط السيليكون على السطح الخارجي للأنبوب.

بمجرد الحصول على الشرائح ، ضع ميكرولترين من بلازما الدجاج في وسط الجانب المحفور بالصورة من غطاء مجهز. انشر البلازما قليلا لتحقيق بقعة قطرها ثلاثة إلى أربعة ملليلتر. ثم استخدم ملعقة معقمة ضيقة الرأس لرفع شريحة دماغ جاهزة.

استخدم ملقطا مغلقا للحفاظ على الشريحة على طرف الملعقة أثناء رفع الشريحة. المس الملعقة ببقعة البلازما الموجودة على الغطاء وباستخدام ملقط مغلق ، ادفع الشريحة على الغطاء. أضف طبقة رقيقة من بلازما الكتاكيت على الغطاء قبل وضع الشريحة وكمية قليلة من البلازما المعالجة بالثرومبين لتغطيتها لتغطية الشريحة.

إذا طفت الشريحة ، فلن تظل ملتصقة عند إزالة السحابة. بعد ذلك ، امزج 2.5 ميكرولتر من البلازما و 2.5 ميكرولتر من الثرومبين في أنبوب منفصل. ضع بسرعة 2.5 ميكرولتر من هذا الخليط فوق الشريحة وحولها والماصة لأعلى ولأسفل برفق لخلطها.

قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الشفاف من الجانب المكشوف من لاصق مطاط السيليكون المثبت مسبقا على أنبوب الأسطوانة. ثم ضع الغطاء مع شريحة الدماغ على المادة اللاصقة لمحاذاة الشريحة داخل الفتحة. لضمان الالتصاق ، قم بالضغط على الغطاء بالإبهام ، عن طريق الضغط على الغطاء لأسفل بالتساوي ، والاحتفاظ به لمدة دقيقة واحدة تقريبا أثناء نقله إلى خزانة السلامة البيولوجية.

يجب أن يكون الضغط على الغطاء للالتصاق بالأنبوب دون تسرب مناسبا تماما ويتم الحفاظ عليه لفترة كافية للتخلص من قنوات الهواء في البارز. الضغط الشديد سوف يكسر الغطاء. في خزانة السلامة البيولوجية ، أضف 0.8 مل من وسيط ثقافة عصبي كامل إلى كل أنبوب.

ثم قم بتدفق خليط هواء بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 95٪ من خلال ماصة باستور قطنية معقمة مثبتة بإحكام بواسطة مشبك. استخدم هذا لشطف أنبوب الأسطوانة بخليط الغاز وتغطية الأنبوب بسرعة أثناء سحبه من حول الماصة. بعد ذلك ، قم بتسمية الأنابيب برقم الشريحة ورقم الرف.

أدخل الأنابيب في رف الأسطوانة ؛ التأكد من أنها متوازنة هندسيا. إذا كان هناك عدد فردي من الأنابيب ، أضف أنابيب فارغة لتحقيق التوازن. ضع الرفوف في حاضنة أسطوانية 35 درجة مئوية ، مع بكرات تدير رف الأسطوانة بسرعة 10 إلى 13 دورة في الساعة.

قم بإمالة الحاضنة للخلف بمقدار 5 درجات تقريبا عن طريق رفع أمامها على لوحة. انقل أنبوبا به ثقافة شرائح إلى حامل أنبوب مخصص مثل الأنبوب الموضح هنا. ثم ضع حامل الأنبوب في محول المرحلة للحفاظ على الغطاء عموديا على الهدف أثناء التصوير.

بعد ذلك ، ادفع شريط التمرير الموجود على محول المسرح بإحكام على الأنبوب لتثبيت الأنبوب في موضعه. باستخدام هدف أربع مرات تحت إضاءة عبر المجال الساطع ، ركز على فترة الشبكة المحفورة بالصورة أسفل الشريحة. بالنسبة لجلسة التصوير الأولية، امسح بسرعة حول الشريحة لتحديد موقع الرقم وتسجيله للمناطق المختلفة التي يرغب فيها التصوير بالتكبير العالي.

بمجرد تحديد مناطق الاهتمام، انقل المرحلة إلى مربع الشبكة الأول الذي يحتوي على منطقة الاهتمام. ثم قم بالتبديل إلى هدف خطأ القوة 20 وحدد موقع علامة ائتمانية. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى هدف قوة أعلى ، وقم بتحديد نفس العلامة الإيمانية ، وسجل موضع x و y للمرحلة.

حرك المرحلة للعثور على مجالات الاهتمام الأخرى القريبة وسجل إزاحات x و y من العلامة الإيمائية. تسمح مواضع الإزاحة بتحديد متسق لنفس موقع الغطاء عند تصوير الشريحة ، على الرغم من أن الإعداد x و y الأصلي للعلامة الإيمانية يتغير عند إزالة الأنبوب أو محول المرحلة واستبداله. التقط صورة Z-stick داخل كل حقل محدد باستخدام عنصر التحكم في هدف المجهر أو عنصر تحكم مرحلة بيزو إذا كان متاحا.

باستخدام صبغة حيوية عصبية ، تظهر المكدس متحد البؤر للصور هنا ، يسلط الضوء على البنية ثلاثية الأبعاد لكل من الخلايا العصبية وجسم الخلية ، ولكن يتم استبعاد البقعة من النواة. لفحص التغيرات المعتمدة على الوقت في مورفولوجيا شريحة النمو وقابليتها للبقاء داخل الشرائح أثناء الثقافة طويلة الأمد ، تم تصنيف نفس الشريحة بصبغة حيوية عصبية فلورية مرة واحدة في الأسبوع ، قبل 24 ساعة من التصوير. لإثبات قابلية تكرار تصوير الخلايا المتطابقة بمرور الوقت ، تم تصوير نفس مجال الشريحة المسمى بصبغة حيوية عصبية في اليوم 13 في الأيام 14 و 15 و 16 و 17.

موضع ثلاث خلايا في كل يوم برمز فوق النواة. بالإضافة إلى الصبغة الحيوية العصبية ، يمكن استخدام بروتينات الفلورسنت بوساطة الفيروسية مع هذا النظام لتسمية الخلايا. هنا يمكن تحديد كل من المراسل الحساس للكالسيوم والقضبان المحتوية على الكوفيلين بوضوح بعد 10 أيام من الإصابة.

التنفيذ الناجح لهذا الإجراء التحضير المسبق لجميع الأنابيب والأغطية والحلول. تعد القدرة على الحصول على شرائح في فترة قصيرة بعد الوفاة أمرا بالغ الأهمية أيضا للنجاح ويتطلب الكثير من الممارسة. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في حوالي 90 دقيقة للحصول على 12-18 شريحة الحصين من جرو الفأر ، بما في ذلك أوقات التشريح والطلاء.

بعد هذا الإجراء ، يمكن أن تصاب شرائح الدماغ في أوقات مختلفة بالفيروسات لتحقيق تعبير محدد من نوع الخلية للبروتينات الموسومة بالفلورسنت أو الصمت للتعبير الجيني مع الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل أو الحمض النووي الريبي القصير لفحص وظيفة الجينات. لا تنس أن العمل مع الفيروسات المؤتلفة يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء واقي العين عند العمل مع هذه الكواشف.