السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف استخدام الببتيد القابل للتنشيط الضوئي معقد التوافق النسيجي الكبير للحث على إشارات مستقطبة في الخلايا الليمفاوية التائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في نقل إشارة الخلايا المناعية مثل كيفية قيام الخلايا الليمفاوية بنقل الإشارات الموضعية السريعة ثم تركيب الاستجابات الخلوية المستقطبة لتلك الإشارات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تحكما زمانيا مكانيا لإشارات الخلايا التائية.

يقوم بذلك عن طريق تحديد الوقت والموقع الدقيقين لتنشيط مستقبلات الخلايا التائية. ستظهر الإجراء إليسا سانشيز ، طالبة الدراسات العليا من مختبري. ابدأ بإضافة بولي إل ليسين البيوتينيل ، أو bio-PLL ، المخفف من واحد إلى 500 في الماء المقطر منزوع الأيونات إلى زجاج غطاء من ثماني آبار.

احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، يغسل بالماء المقطر منزوع الأيونات ثم يجفف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. سد الأسطح المطلية ب PLL الحيوي مع عازلة مانعة تتكون من محلول ملحي مخزن HEPES مع 2٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع من الأسطح المطلية ب bio-PLL دون السماح للآبار بالجفاف. ثم يضاف الستربتافيدين ويحتضن عند أربع درجات مئوية. بعد ساعة ، اغسل الأسطح المطلية في HBS.

املأ واقلب آبار منزلق الغرفة أربع إلى خمس مرات ، وقم بإزالة HBS من الآبار. لا تدع الآبار تجف. أضف الببتيد القابل للتنشيط الضوئي الحيوي ، والروابط المعقدة ذات التوافق النسيجي الرئيسي وجزيئات الالتصاق إما للخلايا التائية الموجبة CD4 أو الخلايا الإيجابية CD8 إلى الأسطح المطلية ب PLL الحيوي.

يحفظ من الضوء ويحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسلها كما كان من قبل واتركها في HBS حتى تصبح جاهزة للبذور. أخيرا ، أضف 200 ، 000 خلية تائية موجبة CD4 أو CD8 موجبة للتعبير عن TCR المناسب في الآبار الصحيحة واسمح للخلايا بالالتصاق عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بمجرد أن تلتصق الخلايا بالسطح وتنتشر عليه ، فإنها تكون جاهزة للتنشيط الضوئي والتصوير. استخدم مجهر مضان انعكاس داخلي مقلوب مزود بعدسة موضوعية 150X متوافقة مع الأشعة فوق البنفسجية للحصول على الصور. راقب المجسات في كل من القناتين الخضراء والحمراء باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر ، على التوالي.

بعد تركيب شريحة الغرفة التي تحتوي على الخلايا التائية ، اضبط إعدادات المجهر للحصول على إضاءة TIRF أو إضاءة التألق ، حسب الضرورة. في الوضع المباشر، حدد حقلا من الخلايا التي تعبر عن مجسات الفلورسنت ذات الأهمية. إنشاء مناطق مقياس ميكرون للتنشيط الضوئي أسفل الخلايا الفردية باستخدام التحكم في البرنامج.

ثم ابدأ عملية الاستحواذ. عادة ما تكون هناك حاجة إلى 80 نقطة زمنية بفاصل زمني مدته خمس ثوان بين كل منها. هذا يترك وقتا للتعرض المتسلسل 488 نانومتر و 563 نانومتر في حالة التجارب ذات الألوان المزدوجة.

بعد ذلك ، بعد الحصول على 10 نقاط زمنية ، قم بتنشيط المناطق المحددة عن طريق فتح مصراع الحجاب الحاجز الرقمي لمدة ثانية واحدة إلى 1.5 ثانية. بعد اكتمال الفاصل الزمني، حدد حقلا جديدا من الخلايا وكرر العملية. ابدأ بتحديد شدة التألق لمنطقة خلفية خارج الخلية لاستخدامها لتصحيح الخلفية.

ارسم منطقة مربعة بحجم ميكرون خارج الخلية وقم بعمل قناع. لتحديد شدة التألق ، انقر فوق تحليل ، قناع الإحصائيات. حدد متوسط شدة التألق وقم بتصدير القيم.

حدد شدة التألق داخل المنطقة المنشطة ضوئيا لكل نقطة زمنية. حدد قناع لتمييز المنطقة التي تم تنشيطها ضوئيا. لتحديد شدة التألق ، انقر فوق تحليل ، قناع الإحصائيات.

حدد متوسط شدة التألق وتصدير القيم. احصل على إحداثيات X و Y لمركز المنطقة المنشطة ضوئيا عن طريق تحديد قناع لتمييز المنطقة التي تم تنشيطها ضوئيا. بمجرد تمييز منطقة التنشيط الضوئي ، حدد تحليل ، وإحصائيات قناع ، ومركز المنطقة ، وتصدير القيم.

حدد إحداثيات X و Y لمسبار الفلورسنت المعني. حدد التتبع اليدوي للجسيمات وانقر على مسبار الفلورسنت الذي يثير الاهتمام بمرور الوقت. بمجرد تعقب جميع النقاط الزمنية، حدد تحليل، وإحصائيات القناع، ومركز المنطقة، وتصدير القيم.

تم ربط الخلايا التائية بزجاج الغطاء الموجود على MCC-IEFK القابل للتنشيط الضوئي. تم تصوير C1-GFP ، وهو مسبار لرسول الدهون الثاني DAG ، باستخدام الفحص المجهري TIRF و RFP-Tubulin في وضع التألق. يؤدي التنشيط الضوئي الموضعي للسطح الموجود أسفل الخلية التائية إلى تراكم DAG في المنطقة المشععة.

يتبع ذلك في غضون ثوان إعادة توجيه الجسيم المركزي إلى نفس المنطقة. يمكن قياس تراكم C1-GFP عن طريق حساب شدة التألق الطبيعي بعد تصحيح الخلفية في مركز المنطقة المنشطة ضوئيا بمرور الوقت. يمكن قياس إعادة توجيه الجسيم المركزي استجابة للتنشيط الضوئي عن طريق حساب المسافة بين الجسيم المركزي ومركز المنطقة المنشطة ضوئيا كدالة للوقت.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من يوم إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عادة ما ننشئ 15 إلى 20 فيلما بفاصل زمني لتحليلها في هذا الوقت. مهد هذا النهج الطريق للباحثين لاستكشاف الحركية الدقيقة والاستقطاب لتنشيط الإشارات في الخلايا التائية.

كما تم تكييفه لدراسة الإشارات المثبطة في الخلايا القاتلة الطبيعية. نتيجة لذلك ، لدينا الآن فهم أفضل لكيفية تجميع تفاعلات الخلايا المناعية المتواصلة وإذابتها.