تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

الهدف العام من هذا الإعداد التجريبي هو تحديد الطبقات الرئيسية لتنظيم الحمض النووي الريبي والحمض النووي للكشف عن الآليات الجزيئية الأساسية التي تحدث استجابة لمحفز أو علاج. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العديد من المجالات البيولوجية المختلفة ، مثل الاستجابات المناعية بشكل عام ، ولكن أيضا الاستجابات الجزيئية للعلاج بالأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكنك من عرض طبقات متعددة من تنظيم الجينات في وقت واحد بمرور الوقت.

لذلك ، من المهم استخدام نفس مجموعة الخلايا لكل طريقة. بشكل عام ، تتضمن هذه البروتوكولات الثلاثة أولا التلاعب بالخلايا ذات الأهمية لنقاط زمنية مختلفة. بعد كل تلاعب ، يتم تجميع الخلايا وتقسيمها إلى ثلاث مجموعات ، واحدة لكل فحص.

يصف هذا القسم من الفيديو وضع العلامات على أحدث النصوص التي تم إنتاجها وتنقيتها باستخدام وضع العلامات على 4sU. ينتج كل بروتوكول في النهاية عينات جاهزة للتسلسل. أولا ، ابحث عن تركيز 4sU المطلوب ووقت الحضانة اللازمين لخط الخلية محل الاهتمام.

على سبيل المثال ، يتم استخدام 200 ميكرومولار 4sU على الخلايا التائية لمدة ساعة واحدة. افصل مجموعة الخلايا بعد العلاج في طبق واحد منفصل لكل طريقة ونقطة زمنية. بعد ذلك ، قم بإذابة العدد المطلوب من 4sU تماما ، وأضف 4sU مباشرة إلى وسط الخلية واحتضان الثقافات حسب التوجيهات.

بعد ذلك ، اجمع الخلايا المسماة 4sU في أنابيب البولي بروبلين. ثم ، قم بالطرد المركزي للخلايا. أعد تعليق الحبيبات في TRIzol عند حوالي ثلاثة ملايين خلية لكل مليلتر ، واحتضان الخلايا في TRIzol في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

الآن قم بإعداد 30 إلى 80 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي ، أو أكثر ، باستخدام الطريقة التي استخدمتها Radle وشركاه. بعد ذلك ، امزج تفاعل البيوتينيل الخاص بالثيول بهذا الترتيب. ابدأ بالماء الخالي من النوكلياز ، ثم المخزن المؤقت 10 أضعاف ، ثم الحمض النووي الريبي ، وأخيرا البيوتين-HPDP.

ثم تخلط مع سحب العينات وتحتضن. تابع خطوة التنظيف لإنتاج عينات من الحمض النووي الريبي الحيوي المنسوخ حديثا الممزوج بالحمض النووي الريبي غير المسمى والموجود مسبقا. بعد ذلك ، قم بتسخين العينات إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم ضعهم على الفور على الجليد. بمجرد أن تبرد كل عينة ، أضف 100 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة مع التناوب لمدة 15 دقيقة. الآن ، قم بعزل الخرزات المزينة بالحمض النووي الريبي المنسوخ حديثا باستخدام عمود مغناطيسي ، ثم قم بمسح الحمض النووي الريبي في 11 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز للتسلسل.

يصف هذا القسم كيفية عزل الحمض النووي الريبي الذي تتم ترجمته بنشاط. تسلسل هذه النصوص مسح الترجمة الديناميكية. إلى جانب بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي ، يسمح هذا الاختبار بحساب معدل دوران الحمض النووي الريبي ومعدلات الترجمة.

ابدأ بإضافة cycloheximide إلى التعليق وخلطه باستخدام الانقلابات. بعد دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، وإزالة الوسط ، وغسل الخلايا بما لا يقل عن 10 مل من PBS مكمل بالسيكلوهيكسميد. بعد ذلك ، قم بشفط الوسط واستبدله ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الثدييات لكل 10 ملايين خلية.

قم بتحليل الخليط لتحلل الخلايا باستخدام إبرة قياس 20 إلى 25. بعد ذلك ، انقل محللة الخلية إلى أنبوب 1.50 مليلتر مبرد مسبقا ، واحتضان المحللة على الجليد لمدة 10 دقائق مع الانقلابات الدورية. بعد 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للمحللات ونقل المادة الطافية إلى أنبوب بارد سعة 1.5 مل.

بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف من 1 إلى 10 من المحللة في الماء الخالي من النوكلياز ، وقم بقياس الامتصاص عند 260 نانومتر. بعد ذلك ، قم بإنشاء 200 ميكرولتر من المحللة غير المخففة ، وعالج كل منها ب 7.5 وحدة من النوكلياز لكل وحدة امتصاص. اسمح للنوكلياز بالتفاعل لمدة 45 دقيقة ، ثم قم بإنهاء التفاعل باستخدام 15 ميكرولتر من مثبط RNase ، أو قم بتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتنقية الحمض النووي الريبي RPF باستخدام مجموعة تجارية ، واتبعه مع استنفاد الحمض النووي الريبي الريبي ، باستخدام مجموعة أيضا. بعد ذلك ، قم بإجراء تنقية PAGE على 500 نانوجرام من الحمض النووي الريبي RPF المعزول. بعد تحضير العينات لتحميلها في الجل ، قم بتغيير طبيعتها ، والأخير وعناصر التحكم ، مع حضانة لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتشغيل العينات عند 180 فولت على مدار 75 دقيقة تقريبا ، وقم بتقييم النتائج. بالنسبة لمجموعة شرائح الهلام ، قم بعمل ثقوب في الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مليلتر باستخدام إبرة معقمة قياس 20. بعد ذلك ، قم بتقطيع شرائح هلام المقابلة لمنطقة النيوكليوتيدات الأساسية من 28 إلى 30 ، ونقلها إلى أنابيب 0.5 ملليلتر المحضرة.

قم بتضمين عينة من التحكم في الحمض النووي الريبي وعينة من التحكم السلبي للتحقق من التلوث. بعد ذلك ، قم بتحميل أنابيب العينة الصغيرة المغطاة في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الأكبر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتجميعات لتقطيع الجل ، ونقل العينة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك ، أضف الماء وخلات الأمونيوم و SDS إلى أنابيب العينة لتصفية الحمض النووي الريبي في تفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، استخدم مجموعة تجارية لإنشاء مكتبة (كدنا) من الحمض النووي الريبي الصغير ، واستمر في تسلسل مكتبة (كدنا). يستخدم ChIP-seq لرسم خريطة لربط عامل النسخ ذي الأهمية في جميع أنحاء الجينوم.

إلى جانب البيانات من توصيف الريبوسوم ومسح جميع النصوص الجديدة ، يكشف ChIP-seq عن التأثير الفعلي لربط عامل النسخ. للبدء ، قم بربط عينات الخلايا باستخدام الفورمالديهايد بتركيز نهائي قدره 1٪ بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف ، أوقف التفاعل عن طريق رفع تركيز الجلايسين إلى 0.125 مولار. ثم اجمع الخلايا واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS المثلج ، وقم بتجميد حبيبات الخلية عند سالب 80 درجة مئوية.

في وقت لاحق ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من محلول تحلل الخلايا الباردة المثلجة مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا ، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بتدوير الخلايا ، وشفط المادة الطافية ، وكرر إضافة المخزن المؤقت للتحلل والحضانة. بعد ذلك ، استخدم صوتنة لتوليد كروماتين منفصم بين 200 و 1 ، 000 زوج أساسي.

بعد ذلك ، قم بإقران الكروماتين بالخرز المغناطيسي المطلي بالأجسام المضادة ، وقم بمسح مجمعات البروتين والحمض النووي في 50 ميكرولترا من محلول الشطف. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من 40٪ RNase والمخزن المؤقت للشطف ، واحتضن العينة لمدة 30 دقيقة. ثم أضف وحدة واحدة من البروتيناز K و 20 ميكروغراما من الجليكوجين إلى العينة ، واحتضنها لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، انقل العينة إلى 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعكس الربط المتقاطع لها. في اليوم التالي ، ضع العينة على المغناطيس لمدة 30 ثانية على الأقل ، ثم اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي محل الاهتمام. بعد ذلك ، قم بتنقية الحمض النووي ، واستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للتحقق ، وتسلسل الحمض النووي.

يمكن أن يؤدي وضع العلامات على 4sU إلى إجهاد الخلايا ويؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. تم استخدام تلطيخ الملحق V و 7-AAD لتحديد الخلايا المبرمجة والخلايا الميتة. بعد تسمية خلايا Th1 ب 4sU باستخدام علاجات مدتها 30 أو 60 دقيقة ، لم تموت الخلايا أو تخضع لموت الخلايا المبرمج.

تم دائما فحص سلامة الحمض النووي الريبي قبل التسلسل باستخدام اختبار قياسي ، لأن هذا له أهمية كبيرة عند معالجة الحمض النووي الريبي. تحتوي المكتبات المضخمة على مجموعة صحية من النيوكليوتيدات. تحتاج ثنائيات المحول المفرطة إلى مزيد من التنقية بواسطة PAGE.

عن الكثير من القوالب أو الدورات العديدة الثقيلة ، والمنتجات الملطخة ، ومنتجات ثنائي المحول ، وجد أن قص الكروماتين يعمل بشكل أفضل عندما كان الجزء الرئيسي من الكروماتين المنفصم حوالي 1 ، 000 زوج أساسي أو أقل قليلا. تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لاختبار قابلية تطبيق الجسم المضاد على تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين. بادئات التحكم السلبية مخصصة للجينات التي لا يتم التعبير عنها في الخلايا ذات الأهمية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر وضع خطة مفصلة للإعداد التجريبي ، بما في ذلك جدول زمني لوقت إضافة 4sU ومتى يتم حصاد الخلايا لكل طريقة. تحقق دائما من الظروف المثلى لوضع العلامات على 4sU عن طريق اختبار تأثير 4sU على بقاء الخلية والاستجابة للإجهاد مسبقا. باختصار ، يسمح لنا هذا النهج بتصور جميع أحداث تنظيم الجينات التي قد تحدث أثناء عملية التنشيط الخلوي.

يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للخلايا المناعية الأولية واستجابتها للمنبهات أو الدواء.