القياس الكمي المطلق من مستويات البلازما MicroRNA في القرود سينومولوغوس، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس المستويات المطلقة للبلازما MicroRNAs باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي في الوقت الفعلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تقييم كمية microRNAs في البلازما ، حتى لو كان مستوى تعبيرها منخفضا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مقارنة البيانات المقاسة ببيانات أخرى من دراسات أو مختبرات مختلفة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى عينات من الأنواع الأخرى لأنه يمكن إنشاء منحنى قياسي باستخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي أو النيوكليوتيدات. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للبحث الانتقالي للتحقيق في المؤشرات الحيوية الواعدة للسلامة. أولا ، قم بإذابة عينات البلازما المجمدة التي تم الحصول عليها من الوريد الفخذي لقرود Cynomolgus على الجليد.

نقل كاشف التحلل في الكلوروفورم على الجليد للتبريد قبل استخراج الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، أضف 1 ، 000 ميكرولتر من كاشف التحلل إلى 200 ميكرولتر من العينة. ودوامة لمدة دقيقة واحدة لضمان الخلط المناسب.

ثم أضف خمسة ميكرولترات من خمسة نانومولر اصطناعي Caenorhabditis elegans microRNA و 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة. دوامة العينة لمدة دقيقة واحدة لخلطها بشكل صحيح. ثم ضع العينة على الثلج لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 12،000 جم ، لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل بعناية 650 ميكرولتر من المرحلة المائية إلى أنبوب دقيق جديد. بعد ذلك ، أضف 975 ميكرولتر من الإيثانول إلى الطور المائي والماصة عدة مرات لضمان الخلط الكامل.

انقل العينة إلى العمود والمحول المقابلين ثم جففها بالمكنسة الكهربائية لمدة ثلاث دقائق باستخدام مشعبات التفريغ. ثم أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول إلى العمود وجففها بالمكنسة الكهربائية لمدة دقيقة واحدة. بعد التجفيف بالفراغ ، أضف 800 ميكرولتر من RWT Buffer إلى العمود ، ومرة أخرى ، جفف بالمكنسة الكهربائية لمدة دقيقتين.

ثم أضف 800 ميكرولتر من RPE Buffer إلى العمود وجففها بالمكنسة الكهربائية لمدة دقيقتين. أضف المخزن المؤقت RPE مرتين ، متبوعا بالتجفيف بالمكنسة الكهربائية. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من الإيثانول إلى العمود.

بعد إضافة الإيثانول ، جفف بالمكنسة الكهربائية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، انقل العمود في أنبوب دقيق جديد وجهاز طرد مركزي بنفس الطريقة عند 12 ، 000 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي ، انقل العمود إلى أنبوب دقيق جديد وأضف إليه 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز.

دع العمود يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق ثم جهاز الطرد المركزي عند 8 ، 000 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، قم بتخزين المصف عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. لتحضير تركيز قليل النوكليوتيد من الحمض النووي الريبي الاصطناعي الذي يتوافق مع microRNA المستهدف ، قم بتخفيف محلول المخزون 10 أضعاف لتحقيق حل عملي بأعلى تركيز لرسم المنحنيات القياسية.

بعد ذلك ، لتشكيل مجموعة متعددة من بادئات النسخ العكسي ، امزج كميات متساوية من الاشعال ذات 20 قوة للحمض النووي الريبي الصغير المستهدف. ثم قم بإعداد مزيج تفاعل النسخ العكسي. ثم أضف 10 ميكرولتر من مزيج تفاعل النسخ العكسي إلى خمسة ميكرولترات من عينة الحمض النووي الريبي.

امزج الاثنين عن طريق سحب العينات عدة مرات. ثم احتضن الخليط على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد وضع العينة في Thermocycler ، ابدأ الدورة.

بمجرد انتهاء البرنامج ، قم بتخزين العينة المكتوبة العكسية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتشكيل تجمع التمهيدي للفحص متعدد الإرسال ، أضف كميات متساوية من خمسة ميكرولترات من بادئات الفحص المقابلة للميكرو RNAs المستهدفة في الأنبوب الذي يحتوي على مخزن Tris-EDTA المؤقت في الحجم النهائي البالغ 1 ، 000 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتشكيل مزيج تفاعل ما قبل التضخيم.

بمجرد الانتهاء من مزيج التفاعل ، انقل 22.5 ميكرولتر من مزيج تفاعل التضخيم المسبق إلى نقطتين وخمسة ميكرولتر من العينة المكتوبة المعكوسة. بعد ذلك ، قم بخلط الماصة لخلط العينة وخلط التضخيم المسبق جيدا واحتضانها على الجليد لمدة خمس دقائق ثم اترك أنابيب PCR في Thermocycler وابدأ التشغيل. بمجرد انتهاء البرنامج ، انقل جميع العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد إذابة العينات المضخمة مسبقا أو غير المضخمة مسبقا ، قم بتخفيفها خمس أضعاف بالماء المعقم. لإنشاء المنحنى القياسي ، قم بالتخفيف التسلسلي 10 أضعاف للعينات المشتقة من قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الاصطناعية. ثم ، قم بتكوين مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في أنبوب محفوظ على الجليد.

ثم أضف 18 ميكرولترا من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي إلى لوحات التفاعل البصرية السريعة ذات 96 بئرا. ثم أضف ميكرولترين من العينات المخففة في الآبار. بعد إغلاق اللوحة بغشاء لاصق ، قم بالطرد المركزي للعينة لفترة وجيزة عند 500 جم لمدة 15 ثانية.

ثم ابدأ برنامج Thermocycler في الوقت الفعلي. استخدم الإصدار 2.4 من برنامج SDS الذي يعمل مع جهاز التدوير الحراري في الوقت الفعلي المقابل لحساب رقم النسخة الأولية لكل عينة. ثم احسب رقم النسخة المطلقة من رقم النسخة الأولية باستخدام برنامج Excel.

تم تحليل كفاءة تضخيم miR-122 و miR-192 و miR-133a عن طريق رسم المنحنيات القياسية ، والتي تشرح العلاقة بين تركيز السجل مقابل دورة القياس الكمي للعينات غير المضخمة مسبقا. تظهر المنحنيات القياسية ل miR-122 و miR-192 و miR-133a علاقة خطية بين دورات القياس الكمي وتركيز السجل للعينات. بعد ذلك ، تم تحليل كفاءة تضخيم miR-1 و miR-499a و miR-206 عن طريق رسم المنحنيات القياسية للعينات المضخمة مسبقا.

لتحليل كفاءة التضخيم ، تم حساب المنحدر باستخدام الانحدار الخطي. يظهر المنحدر في المنحنى القياسي A عدم وجود أمبليكونات محددة عند 1,000 نسخة لكل تركيز ميكرولتر ل miR-499a و miR-206. ومع ذلك ، تم الحصول على الأمبليكونات غير المحددة بسعر 1,000 نسخة لكل ميكرولتر ل miR-1.

هنا ، تم استخدام عينات miR-206 غير المضخمة مسبقا والمضخمة مسبقا في نسخ مكررة لاشتقاق مخططات التضخيم. قدرت قيم دورة القياس الكمي ل miR-206 غير المضخم مسبقا والمضخم مسبقا ب 39.9 ، زائد أو ناقص نقطة واحدة تسعة و 27.0 ، زائد أو ناقص نقطتين اثنين ، على التوالي ، تمثل قيما متشابهة تقريبا بين التكرارات كما هو موضح في المخططات. بعد ذلك ، تم إخضاع microRNAs في البلازما التي تم الحصول عليها من Cynomolgus للتنميط لحساب قيمها المطلقة.

تظهر المخططات النقطية ، التي تم الحصول عليها من التنميط الحمض النووي الريبي الصغير الذي يمثل مستويات التعبير الخاصة بها ، أن miR-122 و miR-133a و miR-192 يمكن اكتشافها بدون تضخيم مسبق. حيث أن miR-1 وmiR-206 وmiR-499a ستتطلب تضخيما مسبقا بسبب مستويات التعبير المنخفضة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس المستويات المطلقة للحمض النووي الريبي الصغير في البلازما ، باستخدام RT-qPCR.

والتضخيم المسبق. من المفيد تحسين الكشف بكميات صغيرة من microRNAs.