تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

الهدف العام لهذا النموذج ثلاثي الأبعاد لشرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة هو تقييم السمية الخلوية والتأثيرات المناعية في نموذج خارج الجسم الحي باستخدام الأنسجة البشرية. يمكن أن تساعد هذه الأساليب في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأدوية وعلم السموم من أجل تقييم السلامة والمساعدة في تقييم الاستجابة الفسيولوجية للمواد في البيئة البشرية الأصلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا قادرون على تقليد أمراض الجهاز التنفسي البشري فيما يتعلق بالسمية الخلوية أو التأثيرات المناعية ، وذلك بفضل استخدام أنسجة بشرية جديدة وقابلة للحياة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات الخلايا البشرية وعلم وظائف الأعضاء والآلية المرضية ، في أمراض الجهاز التنفسي ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لتطبيقات أخرى وكذلك للأنواع الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من أجل تنظيم تقييم الأنسجة البشرية وإنشاء بنية تحتية موثوقة. علاوة على ذلك ، تتطلب عملية الملء الكثير من التدريب والخبرة ، بسبب عدم تجانس الرئتين.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتقطيع القصبة الهوائية عن طريق إدخال أنبوب السيليكون وتثبيته بمشبك مواز للأنبوب بحيث يضغط المشبك على الأنسجة معا بجانب أنبوب السيليكون دون الضغط عليه. أغلق جميع الشعب الهوائية والأوعية الدموية والإصابات الأخرى باستخدام المشابك حتى لا يتسرب أي أغاروز أثناء إجراء الحشو. هناك حاجة إلى مهارة تشريحية جيدة لتقشير الشعب الهوائية الرئيسية.

لا ينبغي توسيع الرئتين كثيرا ، وإلا فإن الأنسجة ستشتت الانتباه ، وإذا لم تمتلئ الأنسجة بدرجة كافية ، فسيكون من المستحيل عمل أي PCLS لأن الأنسجة ناعمة جدا. ثم امزج حجما مكافئا بنسبة 3٪ من الاغاروز منخفض التبلور مع وسط الاستزراع في دورق غرس الخليط في الرئة باستخدام حقنة سعة 15 مل.

قبل إعادة ملء المحقنة بوسط ، أغلق القسطرة بالأصابع أو المشبك لتجنب فقاعات الهواء وارتجاع الاغاروز. قطع أنسجة الرئة إلى ألواح من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات. املأ قطاعة الأنسجة ب 400 مل من EBSS المثلج.

قم بقص نوى الأنسجة الأسطوانية على الفور من ألواح الرئة ، باستخدام مفك براغي شبه آلي مزود بأداة حفر. بعد ذلك ، انقل نوى الأنسجة إلى حامل الأنسجة في قطاعة الأنسجة. ضع الوزن أعلى قلب الأنسجة وابدأ في تقطيع قلب الأنسجة إلى PCLS.

يجب تصريف الوسط من قطاعة الأنسجة إلى دورق ، عن طريق فتح مشبك الأسطوانة الزجاجية. بعد ذلك ، انقل الشرائح من دورق إلى طبق بتري مع وسط الاستزراع. بعد ذلك ، ضع طبق بتري في حاضنة واترك الوسط يسخن قبل خطوات الغسيل.

بعد ذلك ، انقل شرائح الرئة بعناية إلى صفيحة استزراع 24 بئرا بحد أدنى 500 ميكرولتر من وسط الزراعة لشريحتين لكل بئر. لتحضير مزيج رئيسي من محلول العمل ، قم بتخفيف 25 ميكرولترا من كاشف WST-1 و 225 ميكرولتر من الوسط لكل بئر. بعد ذلك ، قم بتعبئة 250 ميكرولتر من محلول عمل المزيج الرئيسي ل WST-1 لكل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

تأكد من تغطية PCLS بالكامل بواسطة كاشف WST-1 أثناء الحضانة. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر مداري عند 200 دورة في الدقيقة ، ورجها بعناية لمدة 30 ثانية لضمان الخلط الشامل لكاشف WST-1. بعد ذلك ، قم بتقطيع 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى صفيحة جديدة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا في نسخ مكررة.

قم بقياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر ، باستخدام قارئ صفيحة دقيقة واطرح الامتصاص عند مرجع 630 نانومتر من الامتصاص عند 450 نانومتر. بعد احتضان PCLS مع أو بدون عوامل اختبار ، انقل 50 ميكرولترا من المادة المطفية في نسخ مكررة إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا. هذا يولد نسخا مكررة من كل بئر معالج من صفيحة 24 بئرا.

قبل الفحص مباشرة ، قم بإعداد مزيج رئيسي من محلول العمل لعامل خال من LDH ، عن طريق خلط 125 ميكرولتر من محلول المحفز مع 6.25 مل من محلول الصبغة للوحة 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بتقطيع 50 ميكرولترا من محلول عمل المزيج الرئيسي في كل بئر يحتوي بالفعل على 50 ميكرولتر من المادة الطافية . احتضن الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد ذلك ، قم بقياس امتصاص كل بئر عند 492 نانومتر ، باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، واطرح الامتصاص عند مرجع 630 نانومتر من ذلك عند 492 نانومتر. للتقييم المجهري ، قم بإجراء مكدسين على الأقل من مكدسات Z الموزعة عشوائيا ، باستخدام cLSM. انقر فوق علامة التبويب العين لاختيار هدف 10 أضعاف.

انقر فوق عبر الإنترنت لاستخدام cLSM كمجهر ضوئي قياسي للعثور على سطح PCLS. ثم انقر فوق "غير متصل" للخروج من إعداد العين. بعد ذلك ، انقر فوق علامة التبويب Acquisition وقم بتشغيل الليزر المناسب للفلوروفورات.

انقر فوق مسار الضوء ضمن علامة التبويب اكتساب ، وقم بإعداد المرشحات والمرايا اللازمة للتجربة. اضغط على الزر المباشر لرؤية عرض مباشر للطبقة المقابلة على الشاشة. حرك التركيز لأعلى أو لأسفل للعثور على سطح PCLS بإشارة حادة.

بعد ذلك ، اضبط الثقب لقناة homodimer-1 الإيثيديوم الأحمر على وحدة هوائية واحدة للحصول على أفضل مقايضة بين كفاءة جمع الضوء والتقسيم البصري ، واضبط قناة الكالسين وفقا لذلك. زيادة الإشارة المكتشفة للكسب. قم بزيادة أو تقليل الإزاحة الرقمية لضبط الخلفية بحيث تظهر باللون الأزرق في الصورة الحية مع جدول قفل لون القناة المنشط.

حدد مربع Z-stacks لتعيين الحدود العليا والدنيا لحجم المجهر. قم بتحويل التركيز ببطء لأعلى أو لأسفل حتى يتم الوصول إلى نطاق 30 ميكرومتر واضغط على تعيين الأخير للحفظ. ثم انقر فوق Live مرة أخرى لإلغاء تنشيط الصورة الحية ، واضغط على بدء التجربة لبدء التصوير.

تظهر هنا ، صور الجدوى المجهرية ل PCLS ، والتي توضح استجابة الأنسجة البشرية للمنظفات كمادة سامة فعالة. يتم تقييم التأثيرات السامة بصريا من خلال تقييم الأنسجة الإيجابية للكالسيين مقارنة بنواة الخلايا الإيجابية للإيثديوم homodimer-1. على الرغم من أن صلاحية أنسجة الرئة البشرية تختلف بين المتبرعين ، إلا أن عدد نوى الخلايا الميتة مقارنة بالأنسجة القابلة للحياة يجب ألا يتجاوز 15٪ من التحكم في الأنسجة.

يعرض هذا الشكل البيانات التمثيلية للتأثير المناعي لسداسي كلورو بلاتينات الأمونيوم ، وهو SLS على أنسجة الرئة البشرية. تم تحديد IL-1 alpha و TNF-alpha خارج الخلية وداخل الخلايا بواسطة ELISA وتم تطبيعها إلى محتوى البروتين الكلي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات علم الأدوية والعلوم الأساسية لاستكشاف الاستجابات الفسيولوجية داخل أنسجة الرئة البشرية القابلة للحياة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء نقاط نهاية أخرى مثل انقباض مجرى الهواء من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل فعالية الدواء الموسعة للقصبات الهوائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم عام جيد لكيفية إنشاء ومعالجة شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ست إلى ثماني ساعات مع توفر النتائج الأولى خلال ال 24 ساعة الأولى ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

ومع ذلك ، لا تنس أن العمل مع مواد بشرية غير مثبتة يمكن أن يكون معديا ، ويجب دائما ارتداء الاحتياطات ، مثل الملابس الواقية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن تتذكر العمل في ظل ظروف معقمة قدر الإمكان.