جيل وعزل الخلايا القبض على دورة الخلية مع كاريوتيبيس المعقدة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طريقة بسيطة لتوليد وعزل الخلايا التي تم إيقاف دورة الخلية مع أنماط نواة معقدة. يمكن أن توفر هذه الطريقة إجابات للأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث اختلال الصيغة الصبغية ، مثل تفاعل الجهاز المناعي مع الخلايا اختلال الصيغة الصبغية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تولد مجموعة خلايا تؤوي فقط أنماط نواة معقدة.

لبدء مزامنة خلايا RPE-1 hTERT ، استخدم الخلايا المذابة حديثا وقم بتوزيعها في طبق زراعة الأنسجة بحجم 10 سم باستخدام ثمانية ملليلتر من وسط النمو القياسي. بعد ذلك ، استخدم مقياس كثافة الدم لتحديد رقم الخلية. ثم احتضان الخلايا بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، استبدل وسط النمو القياسي بوسط يحتوي على خمسة مللي مولار ثيميدين. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية لمزامنة الخلايا على حدود G1S. بعد 24 ساعة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.

ثم أضف وسط النمو القياسي إلى الخلايا المغسولة واحتضنه لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية. أولا ، اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من PBS. ثم أضف وسيطا يحتوي على 500 نانومولار Mps1 مثبط العكس.

احتضان لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف وسط النمو القياسي وأعد الأطباق إلى الحاضنة.

بعد حوالي 72 ساعة من الانقسام الشاذ الأول ، اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من PBS. ثم أضف وسيطا يحتوي على 330 نانومولار نوكودازول. احتضان لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، استنشق وسط nocodazole. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من PBS إلى الطبق واضغط على جانب الطبق للتخلص من الخلايا الانقسامية. قم بتدوير اللوحة بين كل صنبور للسماح بإزالة الخلايا الانقسامية بشكل متساو.

بعد التخليص الأولي ، استنشق أي سائل ملتصق بغطاء وحافة اللوحة. ثم تحقق من اللوحة الموجودة أسفل المجهر بتكبير 10 مرات. ثم اغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS.

بعد ذلك ، أضف وسيطا يحتوي على 330 نانومولار نوكودازول. احتضان لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد التخليص النهائي ، أضف 10 مل من وسط النمو القياسي.

احتضان الخلايا لمدة 12 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل إجراء الفحوصات. يشار إلى الخلايا المتبقية على اللوحة على أنها تم القبض عليها باستخدام خلايا النمط النووي المعقد أو خلايا ArCK. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل خلايا ArCK ويتم تحليل العديد من الميزات الخاصة بخلايا ArCK لتأكيد عزلها.

تظهر خلايا ArCK مستويات متزايدة من مثبطات دورة الخلية p53 و p21 و p16 في تحليل اللطخة المناعية ، في حين أن خلايا euploid و Aneuploid لا تفعل ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خلايا ArCK إيجابية لبيتا جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، والذي يلطخ اللون الأزرق والأخضر بينما خلايا التحكم euploid ليست كذلك. تكشف مخططات التجزئة أن خلايا ArCK هي اختلال الصيغة الصبغية ، وتتميز بمكاسب كروموسومية متعددة وعشوائية وخسائر في الكروموسومات.

تظهر مخططات التجزئة عدد نسخ الخلايا المفردة من الكروموسوم الأول إلى X ، بالنسبة إلى السجل المرجعي euploid المقياس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من إزالة جميع الخلايا الانقسامية أثناء كل خلط. بعد تنفيذ هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات السيتوكين.

ستساعد هذه المقايسات في الإجابة على أسئلة إضافية مثل قدرة خلايا ArCK على التفاعل مع خلايا الجهاز المناعي. لا تنس أن نوكودازول خطير. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء استخدام هذا الكاشف.

بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لعزل خلايا ArCK بكفاءة في المختبر. يمكن إجراء هذا الإجراء في سبعة أيام إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.