صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار

الهدف العام من هذه التقنية هو صنع ومعايرة واستخدام أقطاب كهربائية دقيقة انتقائية لأيون البوتاسيوم أحادية القطب. يتيح استخدام هذه الأقطاب الكهربائية التقييم الكمي لديناميكيات تركيز أيون البوتاسيوم المستحثة في شرائح الدماغ البالغة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم وظائف الأعضاء ، مثل تحديد الآليات الخلوية والجزيئية لتوازن أيونات البوتاسيوم في الجهاز العصبي المركزي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه بالإضافة إلى كونها طريقة سهلة ومباشرة للتصنيع ، تمثل مستشعرات الأقطاب الكهربائية الدقيقة المعيار الذهبي لقياس تركيز أيون البوتاسيوم. لتحضير الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات للسيلان ، ضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. املأ الأنبوب المخروطي بحمض الهيدروكلوريك أحادي المولار، واحتضن الشعيرات الدموية الزجاجية في حمض الهيدروكلوريك مع تحريك لطيف طوال الليل لمدة ست ساعات على الأقل.

بعد ذلك ، اشطف الشعيرات الدموية لفترة وجيزة بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم جففها تماما عند 100 إلى 120 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات. قم بتخزين الشعيرات الدموية المغسولة في حاويات تحتوي على مجفف كبريتات الكالسيوم اللامائية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع قبل الاستخدام مرة أخرى. قبل السيلان ، اسحب الشعيرات الدموية إلى طرف رفيع باستخدام مجتذب قطب كهربائي دقيق.

بعد ذلك ، ضع الأقطاب الكهربائية الدقيقة في وعاء زجاجي باستخدام شريط قابل للتعقيم ، بحيث يتم رفع الأقطاب الكهربائية من الأسفل لمنع كسر الطرف. بعد ذلك ، قم بإزالة ما يقرب من 0.5 مل من محلول السيلان DDS بنسبة 5٪ من الحاوية باستخدام طريقة استبدال النيتروجين. املأ بالونا بغاز النيتروجين وقم بتوصيل حقنة أو أنبوب وإبرة بالبالون.

بعد ذلك ، أدخل الإبرة في حاوية DDS أثناء رسم DDS في حقنة منفصلة عبر إبرة أطول. بعد ذلك ، ضع محلول السيلان على أطراف الماصات وقم بتغطية الحاوية على الفور. ضع الحاوية التي تحتوي على الأقطاب الكهربائية الدقيقة بمحلول السيلانة في فرن مختبر مسخن مسبقا على حرارة 170 إلى 180 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 ساعة أو عند 200 إلى 220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، أخرج الطبق من الفرن. ضع الطبق على مقعد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة للسماح للأواني الزجاجية بالتبريد. قم بإزالة الأقطاب الكهربائية الدقيقة من اللوحة وضعها في وعاء محكم الغلق مملوء بالمجفف.

يمكن استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة السيلانية المحفوظة خالية من الرطوبة لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد السيلان. لتجهيز الأقطاب الكهربائية ، قم بإعداد محلول مخزون من كوكتيل أيونات البوتاسيوم واحتفظ به في وعاء محكم الغلق وغير شفاف في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مخزون من 10 ملليمولار كلوريد الصوديوم 300 ملليمولار المخزنة ب HEPES عند درجة الحموضة 7.4.

إصلاح القطب في مشبك. بعد ذلك ، باستخدام أداة حادة ، أشعل النار في طرف القطب إلى عرض 10 إلى 20 ميكرومتر تقريبا ، ثم قم بإعادة ملء القطب بكلوريد الصوديوم المخزن HEPES باستخدام طرف MicroFil قياس 28 متصل بحقنة. لاحظ أن المحلول الملحي قد وصل إلى نهاية طرف القطب الصغير وتأكد من خلو القطب الصغير من الفقاعات الكبيرة التي يمكن أن تتداخل مع تدفق التيار.

باستخدام ماصة دقيقة، ضع قطرة صغيرة من أيونوفور البوتاسيوم بالقرب من طرف القطب الصغير. إذا تم تشكيل القطب الكهربائي بشكل صحيح ، امتصاص القطرة في الطرف المكسور. املأ القطب الكهربائي إلى حوالي 1 ملليمتر بأيونوفور البوتاسيوم وقم بإزالة الفائض باستخدام المناديل الورقية.

لمعايرة الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، قم بفقاعة جميع محاليل المعايرة والعازلة بشرائح بنسبة 95٪ أكسجين / 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل بدء التجربة. ابدأ في حشو الحمام ب 4.5 ملليمولار من أيون البوتاسيوم المحتوي على أيونات ACSF بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. ضع القطب الانتقائي لأيون البوتاسيوم في حامل القطب المتصل بمقدمة القطب الكهربائي على المناور.

ثم أدخل طرف القطب الكهربائي في تعقيم الحمام. تأكد من أن القطب الأرضي المصنوع من كلوريد الفضة / الفضة مغمور في نفس المحلول وأن التدفق ثابت. قم بتطبيق حلول المعايرة بطريقة تدريجية وسجل التغييرات المحتملة بالمللي فولت عبر طرف القطب.

انتظر حتى يصل الجهد عند طرف القطب إلى قيمة ثابتة قبل التبديل إلى الحل التالي. بعد ذلك ، قم بقياس تغير جهد الحالة المستقرة استجابة لتطبيق محاليل المعايرة على طرف القطب. تأكد من أن ميل استجابة جهد القطب الكهربائي لا يقل عن 52 ولا يزيد عن 59 مللي فولت لكل عشرة أضعاف التغير في تركيز البوتاسيوم.

لتحضير شرائح الحصين ، قم بعمل شق من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات من الجزء الذيلي من الجمجمة لقطع فروة الرأس على طول خط الوسط. أثناء سحب فروة الرأس يدويا ، قم بعمل شقين أفقيين بطول سنتيمتر واحد من الثقبة الماغنوم على طول جانبي الجمجمة. ثم ، باستخدام مقصات دقيقة ، قم بعمل شق على طول خط الوسط من الجزء الخلفي من الجمجمة إلى الأنف.

بعد ذلك ، أدخل ملقطا دقيقا بالقرب من خط الوسط واسحب الجمجمة المقطوعة في جزأين. استخرج دماغ الفأر من الجمجمة واستخدم شفرة لإزالة المخيخ وقشرة الفص الجبهي والبصيلات الشمية ، والتي تقع على التوالي في الأجزاء الذيلية والمنقارية من الدماغ. بعد ذلك ، قم بتركيب كتلة الدماغ على صينية الاهتزاز باستخدام Super Glue.

املأ صينية الاهتزاز بمحلول التقطيع المثلج. بعد ذلك ، قم بقطع أقسام الأنسجة على السهل الإكليلي بسمك 300 ميكرومتر. عادة ما يمكن جمع أربع إلى ست شرائح من الحصين الإكليلي.

بعد قطع كل قسم ، انقل الشريحة على الفور إلى دورق الشريحة الدافئ إلى 32 إلى 34 درجة مئوية. احتفظ بالأقسام عند درجة الحرارة هذه لمدة 20 دقيقة قبل نقل الدورق مع الأقسام إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل. لقياس ديناميكيات أيونات البوتاسيوم ، ضع شريحة الدماغ برفق في الحمام باستخدام ماصة باستور وثبتها برفق في مكانها باستخدام قيثارة بلاتينية مع خيوط من النايلون.

تأكد من أن أطراف القطب المحفز ثنائي القطب متوازية تقريبا مع بعضها البعض ومستوية مع سهل الشريحة. على مدار خمس إلى سبع ثوان ، أدخل الأقطاب الكهربائية ببطء في طبقة CA3 رادياتوم بعمق 40 إلى 50 ميكرومتر تقريبا لتحفيز ضمانات شافر. بعد ذلك ، أدخل القطب الكهربائي الانتقائي لأيون البوتاسيوم بعناية في رادياتوم طبقة CA1 إلى عمق 50 ميكرومتر تقريبا عن طريق خفض القطب ببطء خلال حوالي ثلاث إلى أربع ثوان.

اسمح للإمكانات بالاستقرار عبر القطب الكهربائي قبل تطبيق التحفيز على الشريحة ، والتي تستغرق عادة من خمس إلى 10 دقائق. إذا أظهرت الشريحة تغيرات تلقائية مفرطة في تركيزات أيونات البوتاسيوم خارج الخلية ، فتخلص من العملية وكررها بشريحة جديدة. لقياس إطلاق أيون البوتاسيوم المستحث ، قم بتطبيق مجموعات التحفيز الكهربائي عبر عازل التحفيز أثناء تسجيل الاستجابات رقميا.

قم بتطبيق التحفيز عند 10 هرتز ومللي ثانية واحدة لكل نبضة بدءا من سعة تحفيز 10 ميكروأمبير. قم بتطبيق سعة التحفيز المتزايدة بمعامل اثنين حتى يتم اكتشاف أقصى سعة استجابة للبوتاسيوم. إذا لم تلاحظ أي استجابة، فقم بتحريك موضع القطب الانتقائي لأيون البوتاسيوم بالقرب من موقع التحفيز بزيادات قدرها 100 ميكرومتر.

للتأكد من أن تغيرات تركيز أيون البوتاسيوم يتم بوساطة إطلاق جهد الفعل لضمانات شافر المنشطة كهربائيا ، قم بتطبيق 0.5 ميكرومولار TTX في ACSF لمدة 10 دقائق وكرر بروتوكول التحفيز. وينبغي عدم ملاحظة أي ردود مستثارة. بعد تحضير الأقطاب الكهربائية بمحلول ملحي مخزن ب HEPES المملوء بالعمومة وأيونوفور البوتاسيوم ، يمكن اختبار الأقطاب الكهربائية لاستجابتها السريعة للتغيرات التدريجية في تركيزات أيونات البوتاسيوم في الحمام والاستجابة الخطية لتغيرات أيونات البوتاسيوم في الحمام على مدى نطاق معايرة 0.1 إلى 100 مللي مولار بطريقة تنبأت بها معادلة نرنست.

يمكن رسم إمكانات الحالة المستقرة مقابل تركيز أيون البوتاسيوم في الحمام من أجل تحديد ميل الخط ، والذي يجب أن يكون حوالي V 58.2 مللي فولت وما لا يقل عن 52 مللي فولت لكل عشرة أضعاف التغير في تركيز أيون البوتاسيوم. تم اختبار استجابة الأقطاب الكهربائية الانتقائية للبوتاسيوم بشكل أكبر ولوحظت الاستجابة لزيادة 5.5 مللي مولار في البوتاسيوم مع ثوابت وقت الارتفاع والاضمحلال التي تبلغ حوالي 85 مللي ثانية. بمجرد وضع الأقطاب الكهربائية المحفزة والانتقائية لأيون البوتاسيوم في الأنسجة والوصول إلى خط الأساس المستقر ، يمكن تطبيق نبضات ذات سعة التيار المتزايدة.

يظهر الشكل الموجي لهذا النشاط كزيادة سريعة في البوتاسيوم بمعدل اضمحلال أسي ، والذي يتم إلغاؤه مع تطبيق TTX. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات تقريبا إذا تم إجراؤها بعناية ودقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء طرف القطب صغيرا قدر الإمكان لتمكين تسجيلات دقيقة ولكنها كبيرة بما يكفي للسماح بضوضاء منخفضة.